Stratégies innovantes de RMN énantiorésolues pour l'analyse de principes actifs chiraux à hauts et bas champs magnétiques – INENDRA

La RMN est un outil d'analyse structural puissant et répandu en chimie organique et pharmaceutique. Toutefois, cette spectroscopie n'est pas capable, dans des conditions de routine, de distinguer une paire d'énantiomères, lesquels conduisent à une signature spectrale identique.

Il est ainsi nécessaire de placer la molécule chirale à étudier en interaction énantiospécifique avec une autre entité chirale (agent chiral). Ces interactions (intermoléculaires ou via création de liaisons covalentes) conduisent à des environnements diastéréomorphes devenant discernables par RMN.

La particularité de la méthodologie développée au sein du projet INENDRA est de s'appuyer sur des solvants orientant chiraux (cristaux liquides lyotropes stéréogènes) jouant le rôle d'agent chiral. Au delà du phénomène de reconnaissance chirale, ce type de milieu orientant rend possible la mesure de paramètres de RMN anisotropes (par exemple: les couplages dipolaires et l'anisotropie de déplacement chimique) permettant de discriminer les énantiomères d'un même composé.

Cette stratégie analytique offre en principe certains avantages comme: i) une reconnaissance chirale polyvalente vis à vis de la nature chimique du composé à étudier (discrimination par variation des affinités énantiomères-cristal liquide) et/ou par reconnaissance de forme ; ii) la pluralité des observables anisotropes utilisable pour la discrimination énantiomérique ; iii) l'indépendance du couplage dipolaire vis-à-vis de l'intensité du champ magnétique, permettant l'implémentation de cette méthodologie sur des spectromètres RMN de paillasse (spectromètres à bas champ).

Le développement méthodologique du projet s'appuie sur deux axes principaux:

1) La recherche de conditions expérimentales adéquates s'appuyant sur des cristaux liquides lyotropes basés sur des homopolypeptides, tels que le poly-gamma-benzyl-L-glutamate (PBLG) et le poly-gamma-carbobenzyloxy-L-lysine (PCBLL), et des polyacétylènes chiraux récemment développés, incluant des motifs D-valine (PDA) et L-sérine (L-MSP). Ces deux familles complémentaires de polymères permettraient de distinguer les énantiomères d'une large gamme de principes actifs chiraux comprenant divers groupements fonctionnels.

2) la mise en œuvre d'expériences RMN 1D/2D pour mesurer rapidement les différences de paramètres anisotropes entre deux énantiomères. Celles-ci pourront s'appuyer sur des expériences spatialement sélectives, et d'enregistrement du signal au sein d'un train d'écho de spin afin de collecter des spectres RMN haute résolution en solvant orientant. Également, des approches RMN 2D rapides multi-quanta seront étudiées pour maximiser la séparation des signaux respectifs des énantiomères.

A mi-parcours, le projet INENDRA a engendré des résultats significatifs démontrant l'intérêt de la méthodologie proposée:

La capacité de la spectroscopie RMN, appliquée dans les cristaux liquides chiraux, à différencier des énantiomères de composés pharmaceutiques a été montrée sur quatre principes actifs différents: le flurbiprofène, l'ofloxacine, l'éfavirenz et la fluoxétine (Figures 1 et 2).

La résolution énantiomérique est visualisée par RMN F-19 où les signaux des énantiomères sont séparés de façon très satisfaisante. Dans le cas des deux médicaments mono-fluorés, la séparation est réalisée par variation d'anisotropie du déplacement chimique conduisant à deux singulets bien distinct. Pour un principe actif contenant un trifluorométhyle (CF3), la discrimination chirale implique deux triplets (un par énantiomère) non-superposables via des variations de couplage dipolaire F-19-F-19 et d'anisotropie de déplacement chimique F-19.

Les bonnes résolutions énantiomériques obtenues ont permit de mesurer régulièrement des excès énantiomériques avec une justesse et une précision inférieures à 1%.

Il est intéressant de constater que cette approche est efficace sur des principes actifs impliquant des fonctions chimiques différentes (pour un même polymère chiral: PBLG), ce qui souligne la polyvalence de cette méthode.

Nous sommes récemment parvenus à discriminer pour la première fois un couple d'énantiomères d'un principe actif chiral à l'aide de spectromètres RMN de paillasse (40 et 80 MHz).

La preuve de concept a été effectuée sur la fluoxetine (Figure 2), un antidépresseur (PROZAC) comprenant un groupement trifluorométhyle (Figure 3). Malgré la grande réduction de champ magnétique associée aux spectromètres de paillasse, la résolution énantiomérique demeure tout à fait satisfaisante s'il on compare aux données enregistrées sur un spectromètre à haut champ. Ceci s'explique par l’indépendance du couplage dipolaire vis-à-vis de l'amplitude du champ magnétique, et démontre ainsi l'intérêt de la RMN anisotrope dans la discrimination d'énantiomères. Ce résultat ouvre la voie à l'analyse chirale par RMN à bas champ magnétique, ce qui est un grand pas quant l'accessibilité de la méthodologie proposée.

A travers l'optimisation multi-paramétrique des cristaux liquides utilisés, l'importance de certains facteurs expérimentaux (pas toujours anticipée) sur les spectres RMN anisotropes obtenus a été mise en avant. C'est le cas par exemple de la concentration en soluté, qui a montré un effet significatifs sur la valeur du couplage dipolaire et de l'anisotropie de déplacement chimique. Ce phénomène, encore très peu décrit dans la littérature, est actuellement étudié dans le cadre de ce projet.

Enfin, nous avons montré l'apport des expériences RMN spatialement résolus dans le cas d'utilisation de solvant orientaux non-parfaitement uniforme. En excitant une zone uniforme de l'échantillon, les spectres RMN sont obtenus dans déformations du signal.

Les perspectives pour la seconde moitié du projet se profilent dans deux directions principales:

L'investigation du rôle de certains paramètres expérimentaux sur l'amplitude des observables RMN anisotropes. Il est judicieux de poursuivre cette étude, tant d'un point de vue académique (meilleure compréhension du processus d'orientation et de reconnaissance chirale), qu'analytique afin d'anticiper les meilleures conditions expérimentales. Une étude comparant le pouvoir d'énantiodiscrimination entre des solvants orientant à base de polypeptides versus à base de polyacétylènes est également prévue.

La mise en place de séquence RMN 1D/2D permettant d'améliorer la résolution ou pour atténuer certaines contraintes associées à l'utilisation de cristaux liquides. Au-delà des expériences RMN spatialement résolues permettant de travailler sur cristaux liquides non-parfaitement uniformes, d'autres expériences sont en cours d'implémentation. Les expériences RMN incluant un train d'écho de spins lors de l'acquisition du signal sont à l'essai pour réduire les effets d'inhomogénéités de champ magnétique, lesquelles sont en général plus importantes en solvant orientant (procédure de shimming plus complexe). Également, des expériences de RMN 2D multiquanta sont à l'étude pour améliorer la séparation énantiomérique pour le cas de molécules bioactives polyfluorées.

La chiralité joue un rôle central dans le domaine de la chimie pharmaceutique. Tandis que l'un des deux énantiomères d'un principe actif chiral induit la bioactivité attendue sur la cible biologique (eutomère), l'autre peut conduire à des effets différents, allant de l'absence d'activité à des effets secondaires potentiellement toxiques (distomère). Dès lors, la détermination rapide et précise de l'énantiopureté des principes actifs chiraux est un défi analytique majeur pour la recherche universitaire et l'industrie pharmaceutique. Le projet INENDRA propose d'explorer et d'appliquer des stratégies innovantes de RMN énantiorésolues pour l'analyse chirale de composés pharmaceutiques chiraux à hauts et bas champs magnétiques, en particulier dans le cas de molécules bioactives mono ou polyfluorées.

La proposition présente ainsi trois objectifs de recherche cohérents : i) développer des méthodes innovantes et rapides de RMN en milieux orientés chiraux pour mesurer l'énantiopureté des produits pharmaceutiques avec une performance analytique supérieure à l’état de l’art actuel, ii) la conception de protocoles adaptés pour déterminer l'énantiopureté directement depuis une formulation pharmaceutique et iii) discriminer pour la première fois les énantiomères d'un même principe actif chiral avec un spectromètre RMN (H-1/F-19) de paillasse.

Pour atteindre ces objectifs, INENDRA s'appuiera à la fois sur des phases cristal-liquides chirales enantiodiscriminantes, basées sur des polypetides déjà éprouvés et sur des polyacétylènes prometteurs récemment développés, puis sur le développement de méthodes RMN afin d’obtenir des spectres haute-résolution sur de tels milieux orientés avec une séparation spectrale optimale entre les énantiomères. Ces développements RMN s’articuleront d’une part, autour d’expériences spatialement sélectives et de l’approche SHARPER ("Sensitive, Homogeneous And Resolved PEaks in Real time") récemment proposée pour s’affranchir des déformations et des élargissements des raies issus d’une uniformité spatiale imparfaite du cristal liquide et des inhomogénéités du champ magnétique externe B0 qui peuvent en découler. D’autre part, des méthodes de RMN 2D rapides multi-quantum (approche « maximum quantum ») seront mises en place pour améliorer encore la séparation spectrale des énantiomères dans le cas de principes actifs polyfluorés.

La réalisation du projet INENDRA aboutirait alors à des stratégies de RMN avancées pour une mesure rapide et efficace de l'énantiopureté de molécules bioactives, seules ou dans une matrice médicamenteuse, avec des spectromètres RMN haut-champs et de paillasse. Les retombées de ce projet de recherche en RMN auraient un impact significatif à court terme dans la chimie pharmaceutique où la chiralité moléculaire est enjeu majeur, du design d’un principe actif jusqu’au contrôle de la formulation pharmaceutique. En outre, ces développements sont en bonne adéquation avec le nombre croissant de médicaments approuvés et commercialisés sous une forme énantiomérique pure. Enfin, le développement pionnier de méthodes énantiorésolues sur des spectromètres RMN de paillasse constituerait une étape majeure vers la diffusion d’approches RMN performantes, puisque cette instrumentation plus accessible et ne nécessitant pas de fluides cryogéniques est de plus en plus répandue dans les laboratoires pharmaceutiques et biomédicaux.