Traitement de la Myopathie Congénitale liée à la Myopalladine – TreatMYPN

Pour atteindre nos objectifs, nous combinons :

• Un modèle murin MKO

Le modèle murin constitutif déficient en myopalladine (MKO), fait l’objet d’un suivi longitudinal jusqu’à 12 mois. À chaque palier d’âge (1,5, 3, 6, 9 et 12 mois), le poids corporel est mesuré et la force musculaire évaluée via le test de préhension (“grip test”), permettant de quantifier la faiblesse fonctionnelle. Les muscles prélevés aux différents âges de souris font l’objet d’analyses histologiques classiques (colorations H&E, NADH, Gomori, COX, SDH) couplées à un typage des fibres par immunofluorescence, ceci afin de voir si les phénotypes histologiques observés chez la souris reflètent les altérations observées chez les patients. En parallèle, l’ultrastructure des myofibres est explorée par microscopie électronique. Enfin, la biomécanique est étudiée à deux niveaux : d’une part, sur muscle entier pour évaluer la réponse globale à l’étirement, et d’autre part, sur fibres isolées grâce à des tests de traction-relaxation, d’où sont extraits le module de Young et le temps de relaxation pour caractériser l’élasticité et la viscoélasticité des fibres musculaires des souris.

• Un modèle musculaire 3D (3DMM) pour les études in vitro

Pour modéliser in vitro la MYPN-CM, nous cultivons des cellules satellites murines WT et MKO sur des hydrogels, permettant après quelques jours de culture la formation de myofibres hautement différenciées, matures et contractiles. La qualité de ces 3DMM est validée par l’observation de la striation de la Z-line et par la localisation des noyaux ; dans le modèle MKO, la dissolution des stries Z et la centralisation nucléaire sont des marqueurs pathologiques clés. Après transduction du modèle MKO par le vecteur AAV-MYPN, ces mêmes paramètres structuraux seront réévalués pour déterminer le degré de restauration, puis la contractilité des 3DMM sera mesurée pour confirmer un bénéfice fonctionnel direct de la réexpression de MYPN.

• Analyses transcriptomiques

Afin d’élucider les mécanismes moléculaires sous-jacents à MYPN-CM, nous réaliserons un séquençage de noyaux uniques (snRNAseq) sur muscles MKO et WT, ciblant en particulier les voies liées à l’architecture sarcomérique et à l’homéostasie musculaire. Les changements d’expression des gènes identifiés seront validés par qPCR et immunoblotting pour quantifier précisément les gène et protéines affectés. Pour garantir la translationalité de nos readouts, nous comparerons ces profils transcriptomiques et protéiques aux données obtenues sur biopsies de patients MYPN-CM et contrôles, identifiant ainsi des biomarqueurs robustes applicables en contexte clinique.

• Développement de vecteurs AAV

Le gène humain MYPN sera cloné sous un promoteur dMCK dans un plasmide AAV développé par le Généthon pour optimiser l’expression musculaire. Le clonage et la production virale seront réalisés en partenariat avec le Généthon.

Au cours de cette première année, nous avons fait des progrès décisifs pour mieux comprendre et suivre la myopathie liée à la perte de myopalladine. Notre premier objectif était de mettre au point des marqueurs moléculaires, histologiques et fonctionnels fiables en utilisant à la fois un modèle murin MKO et des muscles en 3D cultivés en laboratoire.

Dès l’âge de 3 mois, les souris MKO (mâles et femelles) montrent déjà des signes de fragilité musculaire : leur force de préhension est réduite d’environ 20 % tant pour les pattes antérieures que pour les pattes postérieures, tandis que leur poids corporel et musculaire diminue, en particulier dans des muscles clés comme le tibialis anterior (TA), le gastrocnémien et le quadriceps. Ces observations suggèrent que certains muscles sont plus vulnérables que d’autres.

À l’échelle microscopique, nos colorations tissulaires et nos examens en microscopie électronique ont mis en évidence une atrophie des fibres et la présence de noyaux déplacés vers le centre des cellules musculaires. Nous avons également observé des fibres en anneau dans le TA et des structures en « capuchons » (caps) dans plusieurs muscles : ce sont des zones périphériques bien délimitées, riches en filaments fins et segments de ligne Z, qui se superposent à la membrane sarcoplasmique. Ces caps correspondent à celles décrites dans les biopsies de patients MYPN-CM, soulignant la pertinence clinique de notre modèle. Ces observations histologiques traduisent une architecture sarcomérique profondément perturbée.

Sur le plan biomécanique, l’étude de fibres isolées de TA confirme ces anomalies : les fibres MKO supportent moins bien la contraction, résistent mal à la déformation (plus de rigidité) et perdent plus vite leur tension après étirement (altération de la visco-élasticité).

Enfin, en culture 3D, les myofibres privées de MYPN affichent une désorganisation de l’α-actinine et des noyaux centraux, démontrant que l’absence de myopalladine compromet directement la structure et la fonction musculaires.

En conclusion, ces marqueurs combinés, diminution de force, modifications tissulaires et altérations biomécaniques, forment une base solide pour évaluer l’efficacité de nos futures thérapies géniques, ouvrant la voie aux prochaines étapes de validation in vitro et in vivo.

Dans les prochains mois, nous compléterons le phénotypage murin sur 120 souris (6 souris × 2 sexes × 5 âges) pour affiner nos readouts fonctionnels et histopathologiques, réduire la variabilité statistique et renforcer la fiabilité de nos marqueurs. Parallèlement, nous allons franchir plusieurs étapes clés pour mener le projet TreatMYPN vers la phase préclinique la plus avancée possible. En effet, concernant les trois objectifs suivants, qui portent sur la production et l’administration de vecteurs AAV-MYPN in vitro et in vivo, nous avons presque achevé le clonage du transgène MYPN sous promoteur dMCK dans un vecteur AAV optimisé par le Généthon ; la production virale sera bientôt lancée et les premiers traitements in vitro ainsi que les injections in vivo seront effectués d’ici la fin de l’année.

Les myopathies congénitales (MC) sont des maladies musculaires monogéniques potentiellement graves qui touchent l'homme dès la naissance ou la petite enfance, et qui ont un fort impact sur la survie et la qualité de vie des patients, entrainant une faiblesse musculaire pouvant aller jusqu’à la perte de la marche. La myopathie némaline (NEM) et la myopathie à « caps » sont deux des CM les plus fréquentes, avec une fréquence estimée à 1 sur 50 000. Elle sont caractérisée par la présence d'inclusions protéiques en forme de bâtonnets (rods) ou caps dans la biopsie musculaire. En 2017, nous avons rapporté une CM liée à des mutations bialleliques dans le gène de la myopalladine MYPN, conduisant à une perte de fonction de la myopalladine, avec des bâtonnets et des caps. Les MYPN-CM sont rares, sans traitement, et ont un impact important sur la qualité de vie des patients en raison de l'apparition précoce d'une faiblesse musculaire. La nature monogénique de la MYPN-CM et la taille du gène de la MYPN la rendent éligible pour une approche de thérapie génique par AAV, mais leur rareté les rend peu intéressantes pour les développement thérapeutique au sein de compagnies pharmaceutiques. Des plus les mécanismes moléculaires à la base des lésions myopathologiques (rods, caps), et de la faiblesse musculaire sont peu connus. Des études dans un modèle murin MYPN knock-out (MKO) ont démontrés que MYPN favorise la croissance du muscle squelettique par l'activation de la voie SRF. Notre analyse myopathologique chez les MKO disponible dans notre laboratoire a montré une atrophie des myofibres, une augmentation des internalisations nucléaires, et des fibres en forme d'anneau, ring fibers, rappelant les caps, jamais rapportées auparavant. De plus la méthode innovante développé dans notre laboratoire qui consiste à créer un modèle de fibres musculaires matures 3D (3DMM) cultivé in vitro sur des gel hydrodynamique innovants par dérivation des cellules souches de souris MKO a montré que les myofibres matures des MKO présentent une dissolution des stries d'a-actinine au niveau de la ligne Z, une accumulation d'a-actinine dans certaines myofibres, et des noyaux centralisés. Afin de développer la thérapie pour la MYPN-CM, nous emploierons une approche translationnelle en utilisant les modèles précliniques complémentaires 3DMM et MKO pour : 1. La définition de readouts moléculaires (sNuclei RNA seq), myopathologiques et cliniques ; 2. Le développement d'une stratégie de thérapie génique par AAV9 avec un promoteur musculaire spécifique et sa validation in vitro sur le modèle 3DMM ; 3. L'évaluation du bénéfice thérapeutique in vivo chez les MKO. L’espertise clinico-myopathologique du coordinateur, la présence d’un phénotype myopathologique clair (ring fibers ect.) chez le MKO et le 3DMM, l’utilisation de technique de pointe maitrisé dans notre laboratoire comme le snRNASeq , ainsi que l’expertise sur la conception des AAV pour le traitement de myopathie (collaboration avec le Généthon) nous permettrons d’accélérer le développement de la thérapie génique pour la MYPN-CM, et de comprendre les mécanismes moléculaires de cette myopathie rare. Le déroulement de ce projet dans un contexte purement académique servira de modèle pour approcher d'autres MC rares.