Partenaires moléculaires de la cotransmission acétylcholine - glutamate dans les vésicules synaptiques des interneurones cholinergiques du striatum. – ALLEGRO

Contexte
Les interneurones cholinergiques striataux (ICS) expriment les transporteurs vésiculaires de l’acétylcholine (VAChT) et du glutamate (VGLUT3) et régulent ainsi le réseau striatal par l’acétylcholine (ACh) et le glutamate (Glu). Les vésicules synaptiques (VS) des ICS peuvent stocker et libérer simultanément ou indépendamment de l'ACh et/ou du Glu pour réguler les activités striatales. Cependant, les mécanismes moléculaires par lesquels les ICS libèrent ces deux neurotransmetteurs restent méconnus. Dans ce projet, nous faisons l'hypothèse que VAChT et VGLUT3 interagissent directement ou indirectement par l'intermédiaire de protéines partenaires pour réguler la cotransmission ACh/Glu. Pour valider cette hypothèse, il est essentiel d'identifier les partenaires protéiques de VAChT et de VGLUT3, de déterminer leur localisation dans les VS en relation avec VAChT et VGLUT3 et d'analyser leur rôle dans la libération d'ACh et de Glu.

Objectifs
L'objectif central de ce projet est de comprendre la complexité moléculaire, morphologique et fonctionnelle de la cotransmission ACh/Glu par les ICS impliquant des partenaires protéiques de VAChT et VGLUT3. En utilisant une approche multidisciplinaire combinant l'analyse computationnelle, la microscopie de super-résolution, le développement de nouveaux outils pharmacologiques ciblant les transporteurs vésiculaires de Glu et la stimulation optogénétique des ICS couplée à des mesures de la libération d'ACh et de Glu, notre projet ALLEGR0 sera organisé autour de trois objectifs :

Objectif 1. Analyse computationnelle des partenaires moléculaires de VAChT et VGLUT3.
En utilisant différentes approches computationnelles, nous allons :
• identifier les partenaires protéiques de VAChT et VGLUT3 par un criblage à grande échelle de paires de séquences de protéines basé sur l'apprentissage profond et par une analyse de coévolution identifiant les résidus interagissants entre les partenaires potentiels et VAChT ou VGLUT3.
• reconstruire les complexes protéiques grâce à de nouvelles approches d'apprentissage profond pour la reconstruction 3D.
• prédire les sites d'interaction de VAChT et VGLUT3 avec leurs partenaires et leur modélisation par docking moléculaire de l'interaction physique antre les domaines de VAChT et VGLUT3 /et ceux des partenaires protéiques identifiés.

Objectif 2. Distribution des partenaires sélectionnés dans les VS des ICS exprimant VAChT et VGLUT3 et étude des interactions partenaires/VAChT ou VGLUT3.
En utilisant des approches de microscopie, nous allons :
• identifier les protéines partenaires présentes dans les VS immunopositives pour VAChT et VGLUT3 par microscopie de super résolution STED.
• mesurer les interactions, dans ces VS, entre les protéines partenaires et VAChT ou VGLUT3 par microscopie FLIM-FRET.

Objectif 3. Rôle fonctionnel des partenaires dans la libération d'ACh et de Glu
Nous testerons le rôle de ces partenaires en combinant des stratégies de silencing avec des mesures de libération d'ACh et de Glu par les ICS stimulés optogénétiquement. Pour cela, nous allons :
• Evaluer le rôle des partenaires protéiques sur la recapture d'ACh et de Glu sur des VS purifiées.
• Développer et valider des senseurs de Glu et d'ACh.
• Caractériser la libération d'ACh et de Glu par les ICS.
• Déterminer l'effet de l’ablation (shRNA) des partenaires sur la libération d'ACh et de Glu par les ICS mesurée à l’aide de senseurs d’ACh et de Glu.

Conclusion
Ce projet permettra ainsi d'identifier les acteurs moléculaires de la cotransmission neuronale ACh/Glu à travers l'étude de la libération d'ACh/Glu par les ICS. Au-delà de sa dimension fondamentale, le projet ALLEGRO devrait également avoir un impact profond sur notre compréhension de la cotransmission ACh/Glu dont le dysfonctionnement est associé à l'usage de substances ou aux troubles alimentaires et éventuellement accélérer la découverte de biomarqueurs et de thérapies.