Détection de bactéries par spectrométrie de masse avec ionisation par désorption laser sur des surfaces fonctionnalisées et couplées à l'électrospray. Vers une détection précoce de la septicémie – MOONSTONE

Afin d'améliorer la capture bactérienne, nous proposons d’immobiliser des anticorps spécifiques sur le pSi. Deux procédés d’immobilisation sont évalués : (i) l’immobilisation des anticorps par chimie click (copper-free click chemistry) sur des molécules de silane-PEG-DBCO organisées en monocouche sur la surface de pSi, et (ii) l’adsorption des anticorps sur trois différents types de surfaces de pSi (surface modifiée par une monocouche de molécules de silane, surface de silice hydrogénée et oxygénée). Les surfaces de pSi sont élaborées par gravure électrochimique. Une large gamme de facteurs de forme (diamètres 10 - 100 nm, profondeurs 3 - 15 µm) est visée afin d’évaluer l’impact du facteur de forme sur la capture et la détection MS des bactéries. Des procédés de silanisation innovants (en phase vapeur et en phase liquide dans l’éthanol) sont développés afin de réduire l’utilisation de solvants organiques. Les surfaces silanisées sont caractérisées par XPS, FTIR, et angle de contact. L’immobilisation des anticorps et la reconnaissance des bactéries sont validées par fluorescence. Le protocole d’immobilisation des anticorps est mis en place sur une protéine modèle, la BSA, avant d’être transféré à un anticorps modèle. Par ailleurs les structures cristallographiques de ce nanocorps et du complexe nanocorps/site cible de la Listéria ont déjà été résolues, permettant de modéliser par dynamique moléculaire les interactions entre ce nanocorps et les différentes surfaces étudiées (conservation de la bioactivité du nanocorps adsorbé ou immobilisé sur le pSi : orientation sur la surface, changements de conformation), ainsi que les effets des différentes surfaces fonctionnalisées chimiquement sur les interactions entre le nanocorps et le site cible de la Listéria (énergie de liaison).

Nous proposons une approche de profilage MS axée sur l'analyse des spectres moléculaires de haute et d'ultra-haute masse (>100 kDa). Tout d'abord, une méthode de désorption laser efficace utilisant un laser dans le moyen infrarouge qui correspond à l'absorption vibratoire des matrices pSi et des liaisons O-H des biomolécules pour produire une plume de molécules bactériennes désorbées neutres au-dessus du substrat. La taille des pores sera également ajustée afin d'optimiser à la fois ses capacités de filtrage par exclusion de taille dans le sang et ses propriétés de désorption laser. Ensuite, une source d'électrospray avec des agents de surcharge qui ionisent efficacement les biomolécules désorbées (des protéines aux bactéries) pour une détection optimale par MS sera développée. Le CDMS est une méthode à molécule unique dans laquelle la masse de chaque ion de bioparticule est déterminée à partir de la mesure simultanée de son rapport masse/charge (grâce au temps de vol) et de sa charge (grâce à la charge-image). Différents instruments seront couplés à la source d'ionisation, ce qui permettra une large gamme de détection de masse sans précédent.

Nous avons tout d’abord identifié quelle modification chimique de surface de pSi serait optimale pour (i) adsorber un nanocorps tout en conservant sa bioactivité (orientation compatible avec la reconnaissance de la bactérie et un minimum de changement de conformation) et (ii) immobiliser par chimie-click un nanocorps sur des molécules de type « silane-PEG-DBCO » organisées en monocouche tout en conservant sa bioactivité. Concernant l’adsorption du nanocorps, trois surfaces de pSi différentes ont été évaluées (une surface hydrogénée par un traitement HF, une surface oxygénée par un traitement UV-O3, et une surface modifiée chimiquement par une monocouche de n-propyldimethylmethoxysilane). Par ailleurs, nos simulations de dynamique moléculaire ont démontré que cette surface silanisée permet d’adsorber un nanocorps modèle (anti-Listeria) dans une orientation compatible avec une reconnaissance de la bactérie et avec des changements de conformation négligeables. Des résultats très différents ont été obtenus dans le cas d’une surface de silicium oxygénée. Concernant l’immobilisation par chimie-click des nanocorps, des simulations de dynamique moléculaire ont été réalisées afin d’optimiser les longueurs des chaînes PEG, la densité des molécules de silane-PEG-DBCO, et le ratio de silane-PEG-DBCO : silane-PEG. Les résultats montrent que parmi les systèmes testés, les monocouches de molécules silane-PEG34-DBCO à 0.3 molécules/nm² améliorent l’accessibilité des nanocorps aux groupements DBCO et limitent l’adsorption non spécifique (estimée à partir de la diffusion des molécules d’eau interfaciales). Ainsi, deux protocoles de silanisation ont été développés afin d’élaborer des monocouches de n-propyldimethylmethoxysilane (en phase vapeur) et des monocouches de silane-PEG34-DBCO (en phase liquide dans l’éthanol car ces molécules sont peu volatiles). Les surfaces de pSi silanisées ont été caractérisées par XPS, FTIR-ATR, et angle de contact.
En parallèle, un procédé de porosification par gravure électrochimique des surfaces de silicium a été mis au point sur des wafers de 2 pouces. Une large gamme de facteurs de forme est désormais accessible de façon reproductible pour un taux de porosité de 80%. Les surfaces ont été caractérisées par MEB et FTIR.
Les premières surfaces synthétisées ont été utilisées afin d’évaluer la capacité de transfert d’énergie d’une irradiation laser à des biomolécules adsorbées dans les pores. D’encourageants résultats ont permis de montrer que ces substrats sont des supports pertinants pour des irradiations UV et proche-infrarouge. Nous avons en effet démontré la capacité de ces substrats, sous une irradiation laser UV à tranferer l’energie photonique aux biomolécules jusqu’à 5 kDa, et même jusqu’à 150 kDa avec l’aide de matrices organiques. Il a également été possible de démontrer la désorption de petites biomolécules par irradiation dans le proche-IR, avec l’aide de graphite, jouant le rôle de transfert d’énergie.

Du côté INL, le développement d’un protocole d’immobilisation de la BSA par copper-free click-chemistry sur des molécules de silane-PEG34-DBCO organisées en monocouche sur une surface de pSi est en cours. L’immobilisation de la BSA sera validée par fluorescence. Le protocole sera ensuite transféré au nanocorps modèle anti-Listéria. L’immobilisation de ce nanocorps sera validée via la détection du site cible de la Listéria par MS. Le protocole pourra ensuite être étendu aux nanocorps des bactéries spécifiques du sepsis. En parallèle, le nanocorps modèle anti-Listéria sera adsorbé sur une surface de pSi modifiée chimiquement par une monocouche de n-propyldimethylmethoxysilane. La conservation de sa bioactivité sera évaluée via la détection du site cible de la Listéria par MS. Les intensités des pics à [M+H]+ du site cible de la Listéria ainsi que celles des fragments associés seront comparées dans le cas d’une immobilisation par chimie click et dans le cas d’une adsorption du nanocorps. Les résultats seront interprétés grâce à des simulations de steered-molecular dynamics (SMD) réalisées en parallèle. Les simulations SMD sont actuellement en cours et permettront de calculer les énergies de liaisons entre le site cible de la Listéria et (i) le nanocorps immobilisé par chimie-click, (ii) le nanocorps adsorbé sur une monocouche de n-propyldimethylmethoxysilane, (iii) le nanocorps adsorbé sur une surface de silice oxygénée. Ces simulations permettront également de caractériser le processus de détachement entre le nanocorps et le site cible de la Listéria (identification des acides aminés en contact tout au long du processus de détachement). Si les simulations sont validées expérimentalement elles pourront être utilisées pour sonder une plus large gamme de monocouches de silane afin d’optimiser la capture des bactéries.
Du côté ILM, il a été démontré qu’il était possible de détecter des biomolécules atteignant 150 kDa déposées sur les surfaces de silicium poreux et silanisé, par un instrument (UltraFleXTrem – Bruker) pour une analyse DIOS-TOF. Le développement d’une nouvelle source d’ionisation, consistant au couplage d’un laser dans le moyen IR avec une source électrospray (DIOS-IR-ESI), est actuellement en cours. Le dispositif est en train d’être assemblé devant un spectromètre de masse, afin de tester ses capacités de désorption/ionisation sur les mêmes biomolécules détectées avec succès par DIOS-TOF. Une fois que cette source sera assemblée et aura expérimentalement pu démontrer sa capacité à la désorption/ionisation de petites à moyennes biomolécules (100 - 5000 Da), nous chercherons à la disposer devant un spectromètre de masse adapté à la détection de biomolécules > 1 MDa. Cet instrument, le CDMS (Charge detection mass spectrometry), a été développé par le laboratoire et nécessitera quelques ajustements électroniques pour détecter des bactéries.

Articles avec mention d’information de financement ANR-22-CE42-0031

• Lavigne, A.; Géhin, T.; Gilquin, B.; Xerri, L. E.; Veillerot, M.; Jousseaume, V.; Chevolot, Y.; Phaner-Goutorbe, M.; Yeromonahos, C., Effects of the physico-chemical properties of amino acids and chemically functionalized surfaces on DIOS-MS analysis. Analytical Biochemistry 2025, 700.
• Yuan, H.; Lima, D.; Comby-Zerbino, C.; Bouanchaud, C.; Chirot, F.; Bain, D.; Zhang, S. J.; Antoine, R., Assessing the matrix effects on MALDI-MS in the positive and negative ion mode detection for protein-protected metal nanoclusters. International Journal of Mass Spectrometry 2024, 503.
• Bain, D.; Yuan, H.; Pniakowska, A.; Hajda, A.; Bouanchaud, C.; Chirot, F.; Comby-Zerbino, C.; Gueguen-Chaignon, V.; Bonacic-Koutecky, V.; Olesiak-Banska, J.; Marsic, Z. S.; Antoine, R., One- and two-photon brightness of proteins interacting with gold. A closer look at gold-insulin conjugates. Nanoscale 2024, 16 (31), 14953-14958.
• Bain, D.; Russier-Antoine, I.; Yuan, H.; Kolay, S.; Maclot, S.; Moulin, C.; Salmon, E.; Brevet, P. F.; Pniakowska, A.; Olesiak-Banska, J.; Antoine, R., Solvent-Induced Aggregation of Self-Assembled Copper-Cysteine Nanoparticles Reacted with Glutathione: Enhancing Linear and Nonlinear Optical Properties. Langmuir 2023, 39 (46), 16554-16561.
• Clothilde Comby-Zerbino, Sylvain Hermelin, Guillaume Montagne, Fabien Chirot, Vincent Motto-Ros, Philippe Dugourd, Christophe Dujardin and Rodolphe Antoine, Comparison of IR 1064 nm and UV 355 nm matrix and pencil assisted-laser desorption/ionization mass spectrometry, Journal of the American Society for Mass Spectrometry (2025) (under revisions).

En préparation
• Reinert. T, Xerri. L, Comby-Zerbino. C, Montagne. G, Gehin. T, Chevolot. Y, Laurenceau. E, , Yeromonahos. C and Antoine. R, Matrix and graphite surface assisted-laser desorption/ionization on Silica Substrates with IR 1064 nm and UV 355 nm laser irradiation, en préparation
Poster
• Laetitia-Eiko Xerri, Thomas Gehin, Emmanuel Drouard, Rodolphe Antoine, Emmanuelle Laurenceau, Yann Chevolot, Christelle Yeromonahos, Development of copper free click chemistry active surfaces for bacteria trapping on porous silicon: gas phase silanisation and molecular dynamics simulations studies
Journée pléniaire 2024 du GDR-B2i

Le sepsis, infection bactériémique du sang, est l'une des premières causes de mortalité chez les patients hospitalisés. Les chances de survie diminuent de 7% par heure, tandis que le diagnostic nécessite 5 jours. Il existe donc un besoin urgent de stratégies de diagnostic rapide. Ce projet vise à développer une plateforme portable innovante pour le diagnostic du sepsis afin de permettre un traitement antibiotique efficace et de lutter contre la surconsommation d'antibiotiques. Le succès de la plateforme dépendra de l'élaboration de surfaces poreuses de silicium fonctionnalisées chimiquement et du développement d'une spectrométrie de masse basée sur le temps de vol dans la gamme de masse élevée en utilisant une désorption IR et une source d'ionisation électrospray. L'empreinte spectrale obtenue permettra de documenter une base de données de spectres de référence dans la gamme de masse élevée. La source d'ionisation développée avec des dispositifs transportables basés sur la spectrométrie de masse sera installée dans un hôpital. Son intégration sera envisagée à des fins d'instrumentation comme outil de diagnostic intégré au portefeuille de tests.