Incorporation métabolique de thioesters latents hautement réactifs : une solution intégrée pour la production de protéines étiquetées et de biopolymères – MISTER

MISTER repose sur une approche intégrée combinant chimie organique de synthèse, biochimie, biologie de synthèse et caractérisation biophysique, structurée de manière à couvrir l’ensemble du projet, de la conception moléculaire à la validation fonctionnelle.

- Conception et étude de réactivité de précurseurs d’oxalyl thioesters (oxoSEA) : la démarche s’inspire de la réactivité des thioesters latents de type bis(2-sulfanylethyl)amide déjà décrits dans la littérature (SEA, Ollivier et al. 10.1021/ol402678a). Le groupe oxoSEA est conçu de telle sorte à pouvoir être introduit à l’extrémité N-terminale de peptides/protéines ou en chaîne latérale d’un résidu lysine (Lys(oxoSEA)). Des études systématiques par suivi cinétique sont réalisées sur des peptides modèles afin de caractériser la réactivité du groupe oxoSEA et explorer l’influence de divers paramètres expérimentaux (pH, nature des tampons, concentration des réactifs, influences des additifs). Ces approches cinétiques sont complétées par des analyses mécanistiques permettant d’identifier les conditions optimales de réaction.

- En parallèle, des approches chimiques et chimioenzymatiques sont explorées pour faciliter l’introduction du groupe oxoSEA dans des domaines protéiques de grande taille (>10 kDa). Ces derniers sont produits intégralement par voie chimique ou par voie recombinante puis modifiés a posteriori dans des réactions de transpeptidation en exploitant la capacité de certaines enzymes à catalyser ces réactions dans des conditions douces de pH et de température.

- L’intégration de la chimie oxoSEA dans des systèmes biologiques repose sur des outils d’expansion du code génétique. Une stratégie d’incorporation site-spécifique d’un acide aminé non canonique porteur du groupement oxoSEA est mise en œuvre, en s’appuyant sur des systèmes orthogonaux aminoacyl-ARNt synthétase/ARNt. Les conditions d’expression sont optimisées afin de maximiser l’efficacité d’incorporation tout en préservant l’intégrité chimique du groupement introduit. Des analyses protéomiques ainsi que des essais de réactivité sont mis en place pour valider la présence et la fonctionnalité du groupement introduit au sein des protéines produites.

- Enfin, les approches développées sont appliquées à des systèmes protéiques modèles en vue de démontrer leur potentiel pour des applications en conjugaison (étiquetage, formation d’homo/hétérodimères de protéines). Sont également explorées des stratégies de polycondensation à partir de monomères protéiques bifonctionnels, combinant une extrémité N-terminale fonctionnalisée par un résidu cystéine et une fonction oxoSEA activable à l'extrémité C-terminale. Les conditions réactionnelles sont ajustées pour favoriser l’obtention d’assemblages de haut poids moléculaire, et les produits sont caractérisés par des méthodes biochimiques adaptées.

VOLET 1 : Mise au point d'une réaction chimique efficace permettant la concaténation de domaines protéiques

En réponse à ce premier objectif, la réaction de ligation envisagée a été conçue et étudiée au laboratoire. Introduit sur la chaîne latérale d'un résidu lysine, nous avons montré qu'un groupe précurseur de thioester (LysoxoSEA) permettait des réactions de ligation à la cystéine, dans une variété de tampon aqueux, dans une large gamme de pH et de température. La réaction opère jusque dans le haut nanomolaire et reste performante même dans des milieux complexes (extraits protéiques bruts de lysats cellulaires) mettant en évidence à la fois sa très grande efficacité et son excellente chimiosélectivité (10.1002/anie.202204992).

VOLET 2 : Introduction d'un résidu porteur d'un groupe précurseur de thioester d'oxalyle (LysoxoSEA) dans des protéines d'intérêt.

Nous avons montré que le résidu LysoxoSEA peut être introduit dans des peptides de petite taille (< 30 résidus) en utilisant les outils classiques de la synthèse peptidique sur support solide (SPPS) (10.1016/j.xpro.2024.103390). La voie chimique permet également de l'insérer dans des petites protéines ou domaines protéiques de taille modérée (< 100 résidus) à l'aide de la SPPS et des chimies de ligation native. Cela a notamment été illustré sur une ubiquitine modifiée en position 48 dont la conjugaison a été réalisée de manière quantitative à une concentration de 50 µM en quelques minutes (10.1021/acs.orglett.3c01846).

Une des ambitions majeures de ce projet est d'articuler la réactivité des précurseurs de thioesters d'oxalyle avec les outils du génie biologique et la production de protéines recombinantes. En complément de l'approche chimique discutée précédemment, des approches biochimiques sont donc explorées pour introduire le résidu LysoxoSEA à l'aide d'enzymes sur des domaines protéiques recombinants. Cette étude a notamment permis d’approfondir la compréhension et d’optimiser des réactions de transpeptidation enzymocatalysées (publications en cours).

Enfin, l’approche biologique fondée sur l'encodage génétique du résidu LysoxoSEA est en cours de développement. À ce jour, aucun variant de protéine modifiée n’a pu être exprimé. Afin d’augmenter les chances de succès d’incorporation, plusieurs analogues de LysoxoSEA ont été conçus et synthétisés et sont actuellement testés.

Les perspectives du projet MISTER s’inscrivent dans la continuité des avancées réalisées.

Un premier axe concerne le renforcement de l’interfaçage entre la chimie des précurseurs d’oxalyl thioesters et les outils de la biologie de synthèse.

Un second axe portera sur l’optimisation et la généralisation des méthodes d’introduction du motif oxoSEA dans des protéines de complexité croissante. L’extension des approches développées à un plus large éventail de cibles, ainsi que la démonstration de leur robustesse à plus grande échelle, permettront de renforcer leur potentiel applicatif, notamment dans des contextes proches de ceux rencontrés en biotechnologie.

Un troisième axe de développement concerne la conception et l’assemblage de structures protéiques de plus grande taille et de complexité accrue. Les stratégies de polymérisation explorées dans le cadre du projet pourront être poursuivies en s’appuyant sur des monomères structuralement optimisés, afin de lever les limitations identifiées et d’accéder à des architectures de plus haut poids moléculaire.

Enfin, les perspectives incluent la poursuite des études fondamentales visant à mieux comprendre les déterminants de la réactivité des systèmes développés.

Ces dernières années, la production de bioélastomères par les outils du recombinant fait l’objet d’intenses efforts de recherche et sont motivées par des applications prometteuses dans le domaine biomédical ou en science des matériaux. Malgré des avancées significatives, le développement d’approches efficaces et polyvalentes pour améliorer et diversifier les propriétés de ces objets reste un besoin important. L’objectif de ce projet est de développer une plateforme intégrée, de la chimie à la biologie de synthèse, permettant l’incorporation dans des protéines de fonctionnalités dérivées de thioesters, activables à la demande et hautement réactives. La réactivité et la chimiosélectivité de ces groupements sera exploitée pour plusieurs applications telles que l’étiquetage de protéines ou la polymérisation de monomères protéiques. La robustesse de l’approche sera validée à travers la production recombinante et la polymérisation d’un monomère de titine, conduisant à l’obtention de polymères dont les propriétés mécaniques miment celles des muscles.