Role des domaines riches en méthionine dans l'homéostasie du cuivre: zoom sur les CueOs – MetCop

Le projet MetCop vise à étudier deux questions fondamentales liées à l’implication des oxydases multicuivre dans l’homéostasie du cuivre : 1) comment les domaines riches en méthionine (Met-rich) gouvernent l’activité oxydase du cuivre(I), et donc la détoxification du cuivre ; 2) quelles sont les conséquences de l’oxydation des Met dans les domaines riches en Met de CueO sur la tolérance au cuivre. La force de cette proposition réside dans la combinaison d’approches in vivo et in vitro, ainsi que dans l’étude de modèles synthétiques et d’une bibliothèque de protéines entières issues de différents organismes, les résultats obtenus par une approche étant intégrés aux autres afin d’enrichir la compréhension globale.

Des CueO provenant de divers micro-organismes, présentant des caractéristiques structurelles variées de domaines riches en Met et des niveaux différents de résistance au cuivre in vivo, ont été sélectionnées. Les sites de liaison du cuivre identifiés dans les CueO sélectionnées ont été reproduits dans des pseudopeptides. Les propriétés de liaison du cuivre élucidées à l’aide de ces modèles synthétiques ont guidé les mutations de CueO et les conditions expérimentales afin de déterminer les propriétés de liaison du cuivre aux domaines riches en Met de CueO. L’activité enzymatique de CueO a ensuite été étudiée. Cette approche a permis d’établir une corrélation claire entre l’activité de CueO in vitro et la résistance au cuivre in vivo, en fonction des propriétés des domaines riches en Met. L’affinité de liaison du cuivre à Met-O a également été exploitée pour comprendre le rôle de Met-O dans la résistance au cuivre des CueOs.

Une des originalités du projet MetCop est son aspect multimodal et multi-échelles, partant de l’étude moléculaire in vitro de l’enzyme sauvage et de mutants guidés par des modèles peptidiques coordinant le cuivre et allant jusqu’à l’évaluation de la résistance cellulaire in vivo au cuivre.

L'affinité respective pour Cu+ et Cu2+ de composés biomimétiques reproduisant les sites potentiels de liaison au cuivre dans les domaines Met-rich a été déterminée. Ces études soutiennent le mécanisme proposé pour l’activité Cu+-oxydase, dans lequel Cu+ et non Cu2+ se fixe aux Met du domaine Met-rich. La faible affinité des peptides pour le Cu(I), suggère aussi que le domaine Met-rich n’agit pas comme un site de fixation du Cu(I), mais comme une « éponge » absorbant le Cu(I) de façon transitoire par un effet coopératif des méthionines du domaine.

De nombreux mutants ciblant les sites de liaison au cuivre au niveau du domaine Met- ont été produits (Cu5, Cu6 et Cu7). Leur activité a été mesurée à la fois en phase homogène par des tests de spectrophotométrie à laide de complexes d'affinité variée pour le Cu+, et par électrochimie après immobilisation de l’enzyme sur une interface électrochimique.

La comparaison des constantes cinétiques en solution de la protéine sauvage et des mutants permet de démontrer que le domaine est impliqué dans l’activité Cu+-oxydase autrement que par l’intermédiaire des Cu6 et Cu7. La délétion de deux ligands du Cu5 quant à elle, conduit à une enzyme inactive, démontrant le rôle clé du Cu5, seul site actif pour l’oxydation du Cu+.

Les données électrochimiques confirment le rôle clé du Cu5 dans l’activité Cu+-oxydase. Elles écartent également les Cu6 et Cu7 comme sites actifs de la CueO. En revanche, les mutants délétés du domaine Met sont aussi actifs que la protéine WT, ne corroborant pas les données en phase homogène. Une différence majeure entre les tests d’activité en solution et l’activité mesurée par électrochimie est la complexation du Cu+. On peut donc raisonnablement proposer que l’ensemble des résidus méthionines présents dans le domaine Met-rich, et pas uniquement ceux impliqués dans la coordination aux sites Cu6 et Cu7, permet la formation d’un complexe transitoire qui contribue à déstabiliser le Cu⁺ fortement chélaté et à le transférer vers le site Cu5.

Pour corréler les activités in vitro aux données in vivo, des cellules bactériennes d’E coli ont été complémentées avec les différents mutants étudiés pour les activités in vitro. Leur résistance à des concentrations croissantes en Cu2+ est une mesure indirecte de l’activité CueO. Le rôle clé joué par le Cu5 et l’effet négligeable du domaine Met-rich est démontré, suggérant une faible chélation du Cu+.

Les recherches menées dans le cadre du projet ANR MetCop ont mis en évidence le rôle déterminant des domaines riches en méthionine (Met-rich) dans l’activité Cu+ oxydase de CueOs de différentes origines. Ce travail original a fait l’objet d’une communication de vulgarisation scientifique sur le site national du CNRS Chimie, contribuant ainsi à la visibilité des résultats auprès d’un large public. De plus, il est montré que la CueO contribue aussi à la résistance au cuivre en anaérobie, mécanisme qu'il s'agira d'élucider.

Le projet MetCop est également à l’origine de deux nouveaux contrats de recherche. Le premier pour le développement d'un biocapteur électrochimique de détection du cuivre. Le second est en lien avec la flexibilité du domaine Met-rich. En effet, les domaines Met-rich sont souvent constitués de boucles désordonnées. A ce jour, seules deux études computationnelles ont montré que la flexibilité des domaines Met-rich des CueOs avait un impact sur l’activité. Par définition, les domaines flexibles n’ont pas de structure 3D stable, et sont donc délicats à analyser. La littérature récente met pourtant en évidence le rôle fonctionnel de la dynamique structurale. Les méthodes basées sur l’IA comme AlphaFold progressent dans ce domaine mais demandent une validation expérimentale. Des techniques avancées (XFEL, RMN, ou cryo-EM) fournissent des informations de conformation mais permettent difficilement de corréler ces changements à l’activité enzymatique. Le projet financé par l'ANR en 2025, aura pour but le développement d'un nouveau concept pour étudier par électrochimie les mouvements de domaines protéiques en présence d’activateurs.

Cofacteur métallique d'enzymes impliquées dans de nombreux processus biologiques, le cuivre est un micronutriment essentiel à la vie. En excès, il est cependant toxique pour la cellule. La compréhension des mécanismes impliqués dans l'équilibre intracellulaire du Cu est donc cruciale.
Les résidus méthionine (Met) connus pour lier le cuivre sont largement présents dans les protéines impliquées dans l'homéostasie du Cu. C'est le cas de la CueO d’Escherichia coli, protéine périplasmique impliquée dans la résistance au Cu in vivo, qui possède un domaine riche en Met (Met-rich domain) proposé pour être impliqué dans l'oxydation de Cu+ en Cu2+ moins toxique. Curieusement, au sein des CueOs, ces régions diffèrent grandement en termes de structure et de teneur en Met selon les micro-organismes.
Le projet MetCop vise à déterminer le rôle des Met-rich domain de CueOs dans les mécanismes sélectionnés par divers micro-organismes au cours de l'évolution pour lutter contre le stress cuivre. Deux questions fondamentales liées à leur implication dans l'homéostasie du cuivre seront abordées: 1) Dans quelle mesure les Met-rich domain régissent l'activité de Cu+ oxydase, et donc la détoxification du cuivre? 2) Quelles sont les conséquences de l'oxydation des Met dans les Met-rich domain sur la résistance au Cu? Grâce à une approche multi-échelles et multidisciplinaire, le projet MetCop permettra d'établir une corrélation claire entre i) les caractéristiques structurales des Met-rich domain d'une bibliothèque de CueOs, ii) les propriétés de liaison du Cu, iii) l'activité enzymatique in vitro et iv) la résistance au Cu in vivo.
L'approche multi-échelles développée dans le projet MetCop implique des cellules entières, des extraits périplasmiques, des protéines purifiées et des peptides synthétiques, permettant un processus itératif de va-et-vient entre les échelles cellulaires et moléculaires pour répondre aux deux questions fondamentales ciblées. Plus spécifiquement, les bases moléculaires de la liaison du Cu aux pseudopeptides conçus à partir des Met-rich domain de CueOs, améliorera nos connaissances sur la coordination Cu-Met, et guidera les mutations de Met présentes dans les Met-rich domain de CueOs de divers micro-organismes. Les modifications d’activité Cu+ oxydase en fonction des caractéristiques structurales des Met-rich domain seront corrélées à la résistance au Cu in vivo. MetCop ambitionne ainsi de déterminer précisément comment et quelle(s) Met(s) des Met-rich domain sont impliquées dans la liaison et la résistance au Cu. Au-delà de l'implication dans l'activité Cu+ oxydase, le projet MetCop envisagera un rôle de ces Mets dans la protection contre les espèces réactives de l'oxygène pouvant être produites en présence de Cu. Il examinera enfin si MsrP, une protéine reconnue pour réduire le(s) Met(s) oxydée(s), peut participer au maintien in vivo de l’activité des CueO.
L'approche pluridisciplinaire se traduit par un panel de méthodologies (certaines étant mises en place spécifiquement pour le projet MetCop) utlisées pour déterminer le rôle des Met-rich domain de CueOs de différents organismes dans la résistance au Cu: biologie moléculaire, bio-informatique, biochimie, design de pseudopeptides chimiques, chimie théoriques et électrochimie. Cette approche multidisciplinaire est permise grâce à un consortium unique possédant une expertise complémentaire en i) génétique pour étudier la tolérance au Cu in vivo (LCB), ii) la biophysique et la biochimie des enzymes redox dont les métalloprotéines à base de Cu (BIP), et iii) la chimie de la liaison du Cu aux peptides (SYMMES).
Une telle approche multi-échelle et multidisciplinaire devrait ouvrir la voie à la compréhension de la sélection évolutive des résidus Met à une position spécifique au sein des protéines impliquées dans l'homéostasie du cuivre.