Nouvelle génération de crosslinkers pour la spectrométrie de masse appliquée aux agents infectieux – NEOCLASSIC

L’interaction entre un pathogène et la surface des cellules de l’hôte est une étape critique de l’infection. La description fine de cette interaction au niveau moléculaire et donc à l’échelle des protéines est cruciale pour comprendre cette étape-clé et pouvoir développer de nouveaux traitements ou vaccins.
Le pontage covalent in vivo couplé l’analyse par spectrométrie de masse (XL-MS) est apparu récemment comme une technique puissante permettant d’étudier les interactions protéine-protéine dans leur environnement natif et de caractériser des réseaux d’interactions protéiques. Dans ces expériences, l’étape de pontage est directement réalisée sur des cellules vivantes, ce qui présente l’avantage de sonder les interactions entres les protéines dans leur environnement natif mais l’inconvénient d’augmenter considérablement la complexité de l’échantillon à analyser. En effet, dans le mélange complexe obtenu après digestion des protéines, les peptides pontés sont très peu abondants par rapport aux peptides non-marqués ou mono-fonctionnalisés par l’agent pontant (l’autre fonction bioconjugable ayant été hydrolysée).
La qualité des informations obtenues en terme d’interactions protéine-protéine dépendant directement du nombre de peptides pontés identifiés, il est absolument nécessaire d’en identifier le maximum. Diverses stratégiques ont été développées dans ce but, sans qu’aucune ne se montre suffisamment efficace pour relever le défi que représente l’étude des interactions hôte-pathogène in vivo.
L’ambition du projet NEOCLASSIC est de repousser les limites du pontage covalent in vivo couplé à la spectrométrie de masse jusqu’à un niveau de sensibilité inégalé afin de décrire de manière la plus détaillée possible les interactions hôte-pathogène au niveau moléculaire.
Pour ce faire, nous proposons la synthèse d’agents pontants auto-clivables qui permettront l’enrichissement exclusif des peptides pontés par chimie click grâce à une élimination massive de tous les autres peptides (en particulier les mono-fonctionnalisés) avant l’analyse en LC-MS/MS. Cela sera réalisé en détournant les stratégies d’auto-immolation qui sont habituellement employées pour contrôler la libération de molécules actives en fonction s’un stimulus. En guise d’exemple d’application, nous montrerons que notre stratégie innovante permet de décrire avec une grande précision les interactions entre Neisseria meningitidis et une cellule cible endothéliale qui représente une étape clé du processus d’infection de ce pathogène humain
NEOCLASSIC s’articule autour de trois volets. Le premier est dédié à la synthèse de ces agents pontants auto-clivables qui se détruiront s’ils ne forment pas de peptides pontés. Deux types de réactifs seront synthétisés. Le premier destiné à des approches grande échelle visant à capturer toutes les interactions existantes entre les protéines. Le second visera une cible protéique connue afin de capturer tous ses interactants possibles. Dans le deuxième volet, nous optimiserons toutes les étapes du protocole d’analyse par LC-MS/MS afin de générer un interactome total de N. meningitidis en contact avec sa cellule cible. Enfin, le dernier volet ciblera l’interaction des pili de type IV de N. meningitidis avec la surface de la cellule hôte en utilisant un réactif auto-clivable ciblé ainsi que le protocole d’analyse LC-MS/MS optimisé, afin d’identifier les récepteurs de ce facteur central de la virulence de nombreuses bactéries pathogènes.
Ce projet repose sur des travaux préliminaires et la complémentarité des trois partenaires en chimie organique, pontage-covalent couplé à la spectrométrie de masse et dans la biologie de N. meningitidis. De plus, même si les approches développées dans NEOCLASSIC visent N. meningitidis, elles pourront être étendues à nombre de pathogènes infectieux. Nous anticipons donc que le projet NEOCLASSIC ouvre une nouvelle ère d’études par pontage covalent in vivo couplé à la spectrométrie de masse.