Interactions Protéine-Protéine en Meiose – PPIMei

1. Approches bioinformatiques prédictives

La prédiction des interfaces protéiques a reposé sur l’intégration de plusieurs sources d’information structurale et évolutive. Des modèles 3D de complexes ont été générés à partir de séquences d’intérêt en combinant : les modèles d’AlphaFold2 (pour les monomères et complexes), des analyses de coévolution entre partenaires protéiques, et des données expérimentales venant guider ou contraindre les modèles (mutants, conservation, désordre structural). Cette approche a permis d'explorer des régions difficiles à modéliser, comme les régions intrinsèquement désordonnées (IDR). À cet effet, une méthode spécifique (SCAN_IDR) a été développée, permettant d’identifier au sein de ces segments flexibles les zones susceptibles de former des interfaces spécifiques et conditionnelles. Ces prédictions ont été utilisées pour générer des hypothèses structurales sur les interactions entre Zip4 et les autres ZMM, entre MutLγ et Msh4/5, ou encore entre EXO1 et MLH1–MLH3. Les modèles obtenus ont servi de base à la conception rationnelle de mutations ciblant les interfaces.

2. Stratégies de validation expérimentale

Les prédictions ont été testées dans des systèmes cellulaires, principalement dans la levure S. cerevisiae. Des mutations ciblant les interfaces ont été introduites dans les protéines d’intérêt, et leur effet a été évalué via plusieurs approches fonctionnelles : Analyse cytologique (immunofluorescence, microscopie, ChIP) pour suivre l’assemblage des complexes et la formation du complexe synaptonemal ; Tests de recombinaison méiotique pour quantifier l’effet des mutations sur la fréquence des crossing-over ; Essais biochimiques et tests d’activité enzymatique (ex. endonucléase MutLγ, activation de Mre11-Rad50) pour valider les conséquences des mutations sur la fonction catalytique ; Conception et test de mutations compensatrices permettant de rétablir une interaction perturbée, offrant ainsi une validation fine des modèles d’interface. Ces validations ont permis de démontrer expérimentalement plusieurs interactions clés et de confirmer des mécanismes d’activation ou d’assemblage proposés par modélisation.

3. Mutagenèse à haut débit (DMS)

Enfin, PPIMei a développé une plateforme de Deep Mutational Scanning (DMS) en milieu bactérien, couplée à un système Bacterial Two-Hybrid (B2H) optimisé. Cette technologie permet de tester l’effet de milliers de mutations sur une interaction protéique donnée, en lisant l'enrichissement des variants par séquençage à haut débit. Elle a été utilisée pour cartographier les interfaces avec une résolution au résidu, identifier des positions critiques pour la liaison, détecter des mutations capables de restaurer une interaction (approche Rescue-of-Interaction). Bien que le développement ait été initialement validé sur des systèmes modèles, cette approche a ensuite été transposée à des protéines mal prédites par AlphaFold2 comme les mini-anticorps (VHH, scFv).

Le projet PPIMei s’est appuyé sur une stratégie résolument intégrée, combinant des approches bioinformatiques prédictives, des technologies expérimentales innovantes à haut débit, et des analyses fonctionnelles en cellule. Cette combinaison a permis d'étudier la dynamique et la spécificité des interactions protéine-protéine impliquées dans la formation des crossing-over méïotiques avec une résolution inédite. Cette approche a été utilisée avec succès pour Zip4, protéine-clé du complexe ZMM, et ses partenaires [1] a permis d’identifier des mutants de perte d’interaction pour valider le mode d'assemblage de ces protéines.

En parallèle, le projet a anticipé et exploité la révolution AlphaFold2. L’intégration de modélisation 3D assistée par apprentissage profond et analyses de coévolution a permis de prédire des interfaces dans des régions désordonnées ou peu structurées, longtemps inaccessibles aux méthodes classiques, avec le développement de l'approche SCAN_IDR [2]. Cette stratégie a ouvert la voie à une analyse fine des réseaux d’interactions où prédominent des domaines flexibles, souvent sous-estimés dans les études structurales. Cette approche SCAN_IDR a par exemple pu être validée dans l’étude du complexe Mre11-Rad50-Sae2, les mutations compensatrices ont permis de valider un mécanisme d’activation de l’endonucléase [3], illustrant la robustesse des outils développés dans PPIMei.

Enfin, [4] a exploré les interactions structurales entre les complexes MLH1–MLH3, MSH4 et EXO1, essentiels à la résolution des jonctions d’Holliday. Les modèles structuraux ont guidé la conception rationnelle de mutations ciblant des surfaces de contact précises, validées ensuite par des essais génétiques et biochimiques. Ces travaux illustrent l’un des objectifs centraux du projet : construire un pont entre prédiction structurale et validation fonctionnelle.

Une des originalités majeures du projet reposait sur le développement et l'application d’une technologie de Deep Mutational Scanning (DMS) dans un système Bacterial Two-Hybrid (B2H) optimisé. Cette méthode a pu être optimisée pour tester des milliers de variants protéiques en parallèle, afin de cartographier avec précision les interfaces d’interaction [5]. Elle a été validée sur des interactions modèles mais au moment de l'appliquer aux protéines d'intérêt ciblées dans le projet, l'arrivée du programme AlphaFold2 nous a permis d'avancer rapidement sur des questions de caractérisation des interactions. Nous avons poursuivi la mise au point du système de DMS_B2H en 2D, ce qui nous a permis de caractériser des surfaces de complexes anticorps antigène (art prép).

[1] de Muyt et al, Genes & Dev (2022), 10.1101/gad.348973.121

[2] Bret et al, Nat Comm (2024), 10.1038/s41467-023-44288-7

[3] Nicolas, Bret et al, Mol Cell (2024), 10.1016/j.molcel.2024.05.019

[4] Roy et al, Nat Comm (2025), 10.1038/s41467-025-59470-2

[5] Guyot et al, BioRxiv (2025), 10.1101/2025.10.29.680610

Le projet PPIMei a permis de poser les bases d’un pipeline technologique robuste, combinant modélisation structurale avancée, criblage mutagénétique à haut débit et validation fonctionnelle. Grâce à son efficacité et sa modularité, cette approche est désormais appliquée à l’étude de réseaux d’interactions protéiques au-delà du contexte de la meiose dans la levure, y compris dans des systèmes complexes liés à la réparation de l’ADN, à la signalisation et la migration cellulaire.

Les outils bioinformatiques développés, notamment ceux intégrant l’apprentissage profond, la coevolution, et les contraintes expérimentales issues de DMS, ont été généralisés pour l’analyse de grands réseaux d’interactions dans divers projets. Ces méthodes sont aujourd’hui employées pour modéliser des complexes protéiques impliqués dans des processus fondamentaux et pathologiques, avec un fort potentiel d’application en biologie structurale, en génétique fonctionnelle et en médecine translationnelle (articles collaboratifs publiés en 2024 dans les journaux comme Nature et Cell).

Par ailleurs, l’approche de mutagenèse à haut débit couplée à des lectures fonctionnelles quantitatives a suscité l’intérêt d’acteurs industriels. Elle a été mobilisée dans le cadre de projets collaboratifs avec l’industrie pharmaceutique, en particulier avec Sanofi dans le cadre de leur programme iDEA-TECH Awards dans le but d’explorer et de reprogrammer des interfaces protéiques d’intérêt thérapeutique. Ces collaborations ouvrent des perspectives prometteuses pour le design rationnel de protéines modifiées, le criblage de cibles, ou encore la compréhension mécanistique de complexes biomoléculaires impliqués dans des pathologies humaines.

Enfin, les outils développés dans PPIMei sont conçus pour être largement diffusables. Une partie des ressources (plasmides, scripts, protocoles, bibliothèques mutagénétiques, serveurs de modélisation) ont été ou seront mis à disposition de la communauté scientifique, afin de favoriser la réutilisation, l’extension et la mutualisation de ces méthodes. À moyen terme, ce socle technologique devrait contribuer à accélérer la recherche sur les interactomes complexes, et soutenir des initiatives en biotechnologie et en biologie fondamentale.

La méiose est un programme cellulaire conservé au cours de l’évolution et orchestré par plusieurs machineries recombinant l’ADN parental en vue de former des crossovers. Le projet PPIMei vise à disséquer les interactions moléculaires impliquées dans ce processus en utilisant une combinaison d’approches de protéomique, de bioinformatique, de criblage des interfaces de complexe par mutagenèse à haut-débit et de tests fonctionnels. L’analyse détaillée de cette voie dans S. cerevisiae aura des implications directes pour notre compréhension des processus équivalents chez l’homme. La méthodologie originale proposée repose sur des développements biotechnologiques utilisant l’évolution expérimentale et le séquençage NGS pour générer un grand nombre de mutants d’interaction. Ces mutants procureront des outils inestimables pour les caractérisations fonctionnelles et seront intégrés comme contraintes pour le développement d’outils de modélisation structurale performants.