e-Substrats pour l'imagerie moléculaire dans les cellules – NIS

Le projet NIS est divisé en 3 tâches majeures :
1- Étude numérique pour la conception et l'optimisation des composants (PAM bi-couleur et NIS)
2- Fabrication et caractérisation des composants
3- Mise en œuvre des substrats en TIRF-M pour l'imagerie d'assemblages viraux en temps réel.

En 1, nous poursuivons trois tâches différentes, la première étant d'améliorer l'optimisation des multicouches planaires tout diélectriques résonants (PAM) en tenant compte de la divergence angulaire de l'émission et de l'efficacité de collection. La seconde tâche consiste à approfondir le concept de PAM en examinant les résonances multiples. Intrinsèquement, les PAM possèdent plusieurs résonances pour le couple (angle d'incidence, longueur d'onde d'excitation). L'optimisation consiste alors à obtenir des résonances pour deux longueurs d'onde distinctes, mais pour la même incidence et éventuellement des facteurs d'amélioration similaires. Enfin, la troisième tâche consiste à concevoir numériquement un PAM structuré, c'est-à-dire le substrat nanophotonique exaltant (NIS), afin de coupler l'exaltation et le confinement du champ avec une distribution spatiale du champ local jusqu'à lambda/3. L'optimisation numérique du NIS sera réalisée à l'aide de formules d'éléments finis (2D/3D) appropriées.

En 2, les composants sont fabriqués en combinant l'expertise en dépôt de couches minces optiques de la plateforme Espace Photonique de l'Institut Fresnel et l'expertise en gravure RIE et lithographie de la plateforme MIMENTO de FEMTO-ST. Les procédures optimales de masquage et de gravure sont en cours d'optimisation. Les PAM/NIS obtenus sont ensuite caractérisés par spectroscopie optique et/ou microscopie optique à champ proche afin d'évaluer leurs paramètres structurels et leur réponse optique.

En 3, nous évaluons les substrats pour la microscopie dans des conditions biologiques réelles, notamment sur les microscopes installés en BSL3 à l'IRIM. Chaque nouveau substrat sera testé avec des systèmes moléculaires entièrement caractérisés comme des membranes lipidiques supportées ou des particules semblables à des virus bien connues. Ensuite, le substrat spécifiquement conçu sera appliqué aux différentes techniques de fluorescence couramment utilisées à l'IRIM. Nous utiliserons aussi la PAM bicolore pour observer simultanément la dynamique de la principale protéine virale et des molécules cellulaires (lipides ou actine) à l'aide de la technique Imaging-FCS (Im-FCS). L'amélioration du champ local autorisera une cartographie mieux définie des propriétés dynamiques de chaque molécule près de la limite de diffraction, ce qui est bien mieux que ce qui est actuellement réalisé. Enfin, nous testerons le NIS et l'étudierons pour réaliser une spectroscopie de corrélation de fluorescence multi-spots simultanée permettant des centaines de mesures simultanées avec une résolution temporelle de l'ordre de la ms à la sub-ms à l'intérieur d'une cellule à une résolution latérale lambda/6.

Dans le contexte de microscopie TIRF, nous avons proposé d’utiliser des empilements, de films minces diélectriques, conçus pour supporter des exaltations du champ contrôlables à l’interface libre des empilements sous une illumination en réflexion totale, quelques soient les conditions d’illumination (longueur d’onde, angle d’incidence, polarisation). Ceci dans le but d'améliorer la sensibilité en TIRF-M. La compatibilité avec les systèmes vivants et le caractère optiquement transparent de ces empilements sont des atouts pour leur utilisation immédiate dans les techniques TIRF-M actuelles. Ainsi, nous avons déjà montré qu’avec ce type de composant, nous pouvons, gagner un facteur 4 sur la détection du virus SARS-CoV-2, marqués de façon fluorescente, déposés à la surface de la lamelle développée et ceci sur un microscope TIRF commercial.

Sur un microscope TIRF dédié, nous avons mis en évidence une augmentation de la fluorescence par un facteur 50 ce qui est un record. La mise en place d’une collaboration avec la société Abbelight est en cours pour l’exploitation de tels composants.

Enfin, nous poussons actuellement le concept plus loin en développant des substrats multicouches structurés permettant l’exaltation du champ tout en contrôlant le confinement spatial du champ. Tout en conservant l'amélioration en sensibilité déjà démontrée, nous souhaitons ainsi améliorer la résolution latérale en TIRF-M grâce à une illumination nanostructurée résultant d'un motif local d'interférence provenant d'une structuration spécifique de l’empilement. Des premiers prototypes ont été réalisées et sont en cours de caractérisation/mise en œuvre en TIRF-M.

Le but ultime du projet NIS est de concevoir spécifiquement des substrats nanophotoniques exaltant pour faire de la nano-bio-imagerie avec des microscopes optiques classique. L'innovation majeure et l'ingéniosité de ce projet est de réaliser du SR-SIM couplé à du SW-TIRF-M en ajoutant seulement un substrat biocompatible optimisé directement adaptable aux microscopes TIRF commerciaux. Cette innovation bénéficiera aux nombreuses plateformes d'imagerie biologique en France et dans le monde. La nature interdisciplinaire de ce projet ne conduira pas seulement à l'originalité en biophotonique, mais au moins 4 domaines différents bénéficieront de développements originaux et ambitieux.

En termes de résonance optique ou d'exaltation du champ dans les PAM, notre méthode d'optimisation permet d'accéder à l'amélioration du champ avec au moins une décade de plus que les structures diélectriques périodiques. En outre, l'introduction d'une microstructuration ou d'une nanostructuration pousse le concept NIS plus loin que PAM, en combinant le meilleur des deux mondes : c'est-à-dire l'exaltation contrôlée du champ et les multifonctions spectrales du PAM avec le confinement latéral obtenu grâce à l'onde stationnaire créée par la structuration.

En termes de défis de fabrication, il s'agit ici de la capacité à structurer des matériaux qui peuvent être gravés de manière très différente, ce qui donne des bords en structure rugueux et indéfinis. Les résultats de ce projet ouvriront la voie vers une large gamme de composants optiques, notamment des revêtements antireflets, des filtres pixellisés ou des métasurfaces optiques.

Enfin, notre approche permettra d'acquérir des images à haute sensibilité et haute résolution spatiale (lambda/10 sur PAM structuré spatialement) et temporelle (< 0,1ms). L'utilisation du NIS proposé pour améliorer le signal fluorescent sans augmenter le bruit d'excitation laser bénéficiera également à des techniques telles que le multispot et l'imagerie FCS ou spt-PALM.

1- Mouttou, A., et al, Optimization of resonant dielectric multilayer for fluorescence imaging, Optical Materials : X 17, 100223 (2023).
2- Mouttou, A., et al, Resonant dielectric multilayer with controlled absorption for enhanced fluorescence imaging, Opt. Express 30, 15365 (2022).

3- Mouttou, A., Lumeau, J., Lereu, A. L., Favard, C. Lame optique biocompatible destine´e a` la microscopie a` re´flexion totale interne et syste`me d’imagerie microscopique comportant une telle lame Brevet FR 2108879 - 24/08/2021.
4- Mouttou, A., Lemarchand, F., Lumeau, J., Lereu, A. L., Favard, C. HARI-coverslips - High Amplitude Resonant Improved – Coverslip Brevet FR 2301673 - 23/02/2023.

Grâce à l’utilisation des ondes évanescente, la microscopie de fluorescence en réflexion totale (TIRF-M) permet d’observer les évènements se produisant à l’interface entre la lamelle du microscope et l’échantillon biologique. Dans la cellule, cet endroit est la membrane plasmique, où se déroulent de nombreux processus tels que l’endo/exocytose, l’adhésion cellulaire qui sont fondamentaux pour la survie cellulaire. C’est aussi à la membrane plasmique que s’assemblent et bourgeonnent, ou à travers elle que sortent, de nombreux virus pathogènes humains (HIV, Sars-CoV2, Influenza). La microscopie TIRF est donc fortement utilisée comme méthode d’observation dans de nombreux domaines de la biologie membranaire. Si cette technique est relativement simple d’utilisation, sa sensibilité tout comme sa résolution latérale restent des facteur limitant pour l’étude d’objet de taille nanométrique tels que les virus. Dans le projet NIS, nous proposons d’agir sur le champ local excitateur en introduisant 1) une exaltation (i.e. pour la sensibilité) et/ou 2) un motif interférentiel (i.e. pour la résolution latérale) du champ évanescent au niveau de la lamelle de microscope. L’originalité du projet réside notamment dans la conception (WP1), la fabrication (WP2) et la validation (WP3) de substrats exaltant et/ou structurant à l’échelle de la lamelle de microscope classique et donc directement adaptable sur tous les microscopes TIRF.

Les structures de départ choisies pour répondre à ces objectifs sont les empilements multi-diélectriques planaires (PAM) qui peuvent être conçus pour supporter des exaltations de champ jusqu'à 10^4 et ce quelque soit les conditions d’illumination, ce qui les rend intéressants pour améliorer la sensibilité en microscopie TIRF. Cependant, les PAM sont originellement conçues pour un éclairage en ondes planes ce qui ne correspond pas aux conditions d’illumination en microscopie. Nous voulons donc dans ce projet pousser ce concept plus loin pour l’adapter à la microscopie TIRF en tenant compte et des conditions d’illumination par l’objectif (donc à forte divergence angulaire) et de la collection de fluorescence par l’objectif (WP1-T1 et WP2-T1).

En parallèle, nous souhaitons pouvoir imager deux molécules de façon simultanée pour soit visualiser l’interconnexion moléculaire entre la cellule et le virus durant l’assemblage viral, soit observer en temps réel l’assemblage de différentes protéines du virus. Dans le projet NIS, nous utiliserons l’assemblage du VIH-1 dans des cellules T vivantes infectées comme modèle (WP3-T2). Pour ce faire, nous adapterons la conception et la réalisation du PAM pour le développement d’un PAM deux-couleurs avec un facteur d’exaltation du même ordre de grandeur et avec des angles d’incidence proches (WP1-T2 et WP2-T1).

Enfin, nous proposons d’étendre notre concept pour, en plus d’améliorer la sensibilité en TIRF-M, améliorer sa résolution latérale grâce à un éclairage structuré avec une résolution spatiale estimée à ?/10 (déjà conçu numériquement WP1-T2 et T3). Dans ce cas, nous allons structurer le PAM en optimisant le compromis entre exaltation du champ donnée par le PAM et la distribution du champ introduite par la nano- micro-structuration 3D du PAM ; i.e. substrat nanophotonique innovants (NIS). Le but final de notre projet est de valider leur utilisation pour i) améliorer la précision en microscopie à molécule unique et la sensibilité en imagerie de corrélation pour suivre la dynamique d’événements moléculaires survenant à la membrane cellulaire, comme le bourgeonnement viral, ii) faire de l’imagerie rapide et sensible avec une résolution spatiale sub-longueur d’onde.

Les lamelles de microscope ainsi conçues seront rapidement et facilement commercialisable comme un consommable de microscopie accessible à la communauté des biologistes tout en permettant un net gain dans la sensibilité et la résolution latérale de l’échantillon observé.