Nano-imagerie électrochimiluminescente d'objets individuels – ELISE

L’électrochimiluminescence (ECL), aussi appelée «chimiluminescence électrogénérée«, peut être définie comme la production de lumière suite à une réaction électrochimique initiale se produisant à la surface d'une électrode. Elle associe intimement l’électrochimie et la photochimie. Actuellement, cette méthode repose principalement sur la réaction d'un luminophore et d’un coréactif sacrificiel dans des solutions électrolytiques aqueuses. L'état excité du luminophore est généré par une réaction de transfert d'électrons très exergonique entre des espèces électrogénérées. Par la suite, le luminophore retourne à son état fondamental en émettant un photon (?ECL). Le système ECL le plus efficace et le plus largement utilisé est composé du luminophore tris(bipyridine) ruthénium(II) ([Ru(bpy)3]2+) et du coréactif sacrificiel tri-n-propylamine (TPrA), qui produit une lumière rouge. Le processus d'émission de lumière ECL ne nécessite pas de lumière incidente pour générer l’état excité. L’ECL se caractérise par un signal lumineux avec un bruit de fond quasiment nul, évitant aussi les effets de photoblanchiment, d'autofluorescence ou de phototoxicité. L’ECL est principalement utilisée dans des applications (bio)analytiques. Cela est aussi dû à ses propriétés intrinsèques remarquables : grande sensibilité, linéarité du signal, sélectivité, génération in situ des réactifs.
L'imagerie d'objets uniques ou de domaines nanométriques par ECL constituait un défi majeur dans ce domaine, de même que l'imagerie ultime au niveau de la molécule unique. Cela s'explique probablement par le fait qu'elle nécessite les efforts conjoints d'experts au moins de l'ECL et de la microscopie de super-localisation (SLM) au niveau de l'objet unique et de la molécule unique. L'optimisation de l'intensité de l'ECL, potentiellement à différentes longueurs d'onde, et le contrôle précis de l'épaisseur de la couche émettrice de l'ECL, qui est confinée à la surface de l'électrode, étaient d'autres défis majeurs à relever pour combiner l'ECL et la SLM. La réactivité des systèmes ECL modèles (typiquement, [Ru(bpy)3]2+ et la TPA) demeure un domaine de recherche très actif. Enfin, il existe une demande urgente d'approches analytiques permettant une quantification précise du transport de composés biologiquement actifs à travers les membranes cellulaires. L'ECL étant basé sur une étape électrochimique initiale, le transport des réactifs ECL ou des biomolécules à travers les membranes peut permettre de suivre la cinétique de perméation des membranes. Pour approcher les performances des microscopies à fluorescence utilisées dans la plupart des études biologiques, l'ECL doit permettre l'imagerie au niveau de nanodomaine unique (jusqu'à la protéine/molécule unique). Dans ce contexte, le projet ELISE a cherché à combiner l'ECL avec la SLM afin de développer de nouvelles méthodes de nano-imagerie ultrasensibles basées sur l'ECL pour l'analyse d'entités uniques.

Le projet s’est articulé autour du triptyque : étude mécanistique de l’ECL, développement instrumentale et méthodologique, applications en bio-imagerie. La compréhension fine des mécanismes ECL réalisée en collaboration avec l’ITODYS a permis d’amplifier le signal ECL au niveau de billes fonctionnalisées pour l’immunodosage en utilisant des complexes d’iridium dissous en solution. Ces études ont ouvert la voie à de nouvelles collaborations sur l’étude de luminophores organométalliques impliquant des complexes de ruthénium et d’iridium et leurs réactivités ECL croisées. Nous avons ainsi pu réaliser l’imagerie bimodale de cellules par ECL positif et négatif.
En collaboration avec l’Institut de la Vision, nous avons étudié la question centrale de la concentration minimale du luminophore ECL nécessaire pour obtenir des images d'entités uniques. Nous avons démontré la possibilité d'enregistrer des images ECL de cellules et de mitochondries uniques à des concentrations de l'ordre du nM et du pM. Ces concentrations sont inférieures de 7 ordres de grandeur aux concentrations classiquement utilisées et correspondent à quelques centaines de luminophores diffusant autour des entités biologiques. L'approche décrite est une méthode simple, rapide et très sensible, qui ouvre de nouvelles voies pour l'imagerie ECL ultrasensible et la réactivité ECL au niveau de la molécule unique. Ce dernier aspect a été démontré au niveau de membranes cellulaires. Micalis a effectué l’analyse protéique de sécrétome totale de Campylobacter jejuni afin de corréler l’imagerie ECL des vésicules extracellulaires libérées par la bactérie avec leur composition.

Les travaux sur le projet ELISE sont encore en cours. Cependant, on peut identifier deux principales directions pour les perspectives ouvertes par ce projet. La première porte sur l’amplification du signal ECL qui a été permise par la compréhension fine du mécanisme ECL, en étudiant notamment l’ajout d’un médiateur redox en solution. La seconde concerne le développement des différentes variantes de la microscopie ECL qui ont été développées et qui apportent des informations complémentaires à la microscopie de fluorescence plus classique.

Les résultats obtenus dans le cadre du projet ELISE ont été publiés à ce jour dans les articles suivants :

Truchet, S. et al. (2025). Visualization of the Biogenesis, Dynamics, and Host Interactions of Bacterial Extracellular Vesicles. Chem. Biomed. Imaging, DOI : 10.1021/cbmi.5c00002

Kneževic, S, et al. (2024). Electrochemiluminescence Microscopy. Angew. Chem. Int. Ed., e202407588

Kneževic, S, et al. (2024). Enhanced electrochemiluminescence at the gas/liquid interface of bubbles propelled into solution. J. Am. Chem. Soc., 146, 22724

Kneževic, S, et al. (2024). Electrocatalytic amplification of coreactant electrochemiluminescence using redox mediators. Electrochimica Acta, 499, 144677.

Adamson, N. S. et al (2024). Electrochemiluminescence Enhanced by a Non-Emissive Dual Redox Mediator. Angew. Chem. Int. Ed., 63, e202412097

Descamps, J, et al. (2023) Ultrasensitive imaging of cells and sub-cellular entities by electrochemiluminescence. Angew. Chem. Int. Ed. (135) e202218574

Kneževic, S, et al. (2023) Bimodal electrochemiluminescence microscopy of single cells. Anal. Chem. (95) 7372–7378

Kerr, E, et al. (2023) Electrochemiluminescence amplification in bead-based assays induced by a freely diffusing iridium(III) complex. ACS Sensors (8) 933–939

Kneževic, S, et al. (2022). Electrochemiluminescence microscopy: from single objects to living cells. Current Opinion in Electrochemistry, 35, 101096

Liu, Y, et al. (2021) Single biomolecule imaging by electrochemiluminescence. J. Am. Chem. Soc. (143) 17910–17914

L’électrochimiluminescence (ECL) est l’émission lumineuse produite par l’état excité d’un luminophore qui a été généré suite à une réaction électrochimique initiale. Il s’agit donc d’une méthode hybride couplant de façon orthogonale une stimulation électrochimique et une détection optique. L’ECL est une technique analytique puissante qui suscite un grand intérêt pour l’imagerie ainsi que pour le diagnostic médical. Ce projet combine l’ECL avec la microscopie de superlocalisation pour le suivi dynamique 3D d’objets individuels (en électrochimie et en biologie), jusqu’à la sensibilité ultime de la molécule individuelle. Nous proposons une approche originale utilisant une localisation optique de précision nanométrique, avec tous les avantages liés à l’absence de photo-excitation. Dans un premier temps, l’optimisation des conditions d’imagerie requiert une étude approfondie des mécanismes ECL pour contrôler la distribution spatiale des intermédiaires réactionnels et donc de la couche d’illumination ECL au voisinage de la surface de l’électrode/d’un objet. La compréhension mécanistique viendra soutenir l’optimisation des processus de transfert d’énergie grâce aux outils de la biologie moléculaire afin d’amplifier le signal ECL et ainsi visualiser par imagerie ECL des organelles spécifiques. Le développement d’outils et d’instrumentations optiques originales d’imagerie de l’amplitude et de la phase optique créera une nanoscopie ECL qui permettra d’imager et d’étudier des nano-objets et des entités biologiques individuelles, avec une résolution jusqu’alors inégalée en ECL. L’équipe du projet ELISE réunit cinq partenaires qui ont des expertises complémentaires en ECL, électrochimie, simulations, nano-optique, biologie moléculaire et microbiologie.