Production de superoxyde par transferts d'électrons transmembranaires – SuperET

Les NADPH oxydases (NOX) sont les seules enzymes connues dédiées à la production d’anions superoxyde pour détruire les pathogènes. Le flavocytochrome b558, cœur catalytique des NOX, est enchâssé dans la membrane des phagosomes et catalyse les étapes ultimes de transferts d’électrons (TE) transmembranaires qui conduisent à la production des anions superoxyde via la réduction à un électron de dioxygène. Les mécanismes moléculaires couplant TE transmembranaires et production de superoxyde, notamment leur caractérisation cinétique et thermodynamique, sont très largement inconnus à ce jour. La première structure au rayons X de la variante NOX5 en 2017 a révélé des indices précieux notamment la localisation de deux hèmes au sein du domaine transmembranaire et des sites possibles de fixation du dioxygène. Dans le projet SuperET, notre stratégie repose sur une synergie expérience/théorie pour d’une part obtenir les premières mesures résolues en temps des transferts d’électron transmembranaires dans la variante NOX2, et d’autre part étudier ces mécanismes de TE grâce à des simulations numériques au-delà de l’état-de-l’art. Les hypothèses mécanistiques issues de la modélisation seront testées en étudiant des mutants à la fois expérimentalement et par simulation, afin d’enrichir le dialogue entre les deux approches.
Expérimentalement, l’initiation de la chaine de transferts d’électrons est un facteur clé qu’il est nécessaire de contrôler pour accéder à la cinétique des différentes étapes. Deux voies seront explorées en parallèle pour y parvenir. D’une part, la radiolyse pulsée picoseconde en condition réductrice sera utilisée pour produire in situ des radicaux carboxyles qui iront réduire la flavine et initier les TE. Cette méthode, qui sera mise en œuvre à l’Institut de Chimie Physique sur le montage ELYSE, présente l’avantage de pouvoir être utilisée directement sur la protéine NOX2 non modifiée. D’autre part, nous mettrons au point des systèmes de NOX2 photoactivables à l’aide de complexes de Ruthénium fixés à la protéine à proximité des cofacteurs rédox dont le rôle sera de donner des électrons à la flavine sous excitation UV-visible. Des mesures d’absorption transitoire résolue en temps (nanoseconde-milliseconde) seront réalisées.
Concernant le volet théorique, nous réaliserons des simulations de dynamique moléculaire des variantes NOX2 et NOX5 insérées dans une membrane peptidique pour en étudier la structure et la dynamique, ainsi que la diffusion de molécules de dioxygène et d’anions superoxyde. Les paramètres thermodynamiques et cinétiques des TE seront obtenus à l’aide de méthodologies éprouvées de type QM+MM dans le cadre de l’approximation de la réponse linéaire. Dans nos simulations, une attention toute particulière sera portée au traitement des interactions électrostatiques, en utilisant le champ de forces multipolaire/polarisable AMOEBA, pour lequel nous développerons notamment des paramètres pour la flavine dans ses différents états rédox.
Notre consortium inclut des experts en simulations de protéines membranaires, de transferts d’électrons, de biochimistes spécialistes des NOX, d’experts en radiolyse pulsée et en photochimie/photobiologie appliquées aux mesures de cinétiques de TE du milieu biologique. Il possède un large panel d’expertises qui, combinées, sont à mêmes de mettre en œuvre les études du projet SuperET et ainsi permettre d’aboutir à la première caractérisation à l’échelle moléculaire des transferts d’électron dans les NOX.