Production de superoxyde par transferts d'électrons transmembranaires – SuperET

1) Utilisation du logiciel alphafold pour construire des modèles de la protéine NOX2 seule et en complexe avec certains de ses partenaires cytosoliques

2) Dynamique moléculaire classique pour l’étude de la structure de protéines NOX enchassées dans des membranes lipidiques

3) Approche QM+MM pour le calcul des paramètres de Marcus pour le transfert d’électron

4) Production de différentes formes de la protéine NOX2 par méthodes de biologie moléculaire

5) Etudes spectroscopiques résolues en temps du transfert d’électron dans NOX2 avec initiation induite par radiolyse pulsée ou par photoactivation d’un complexe de ruthénium

Plusieurs modèles de la protéine NOX2, seule ou en présence de ses partenaires cytosoliques, ont été construits à l’aide du logiciel Alphafold.

La chaîne de transfert d’électron depuis le cofacteur flavine jusqu’à l’hème terminal a été caractérisée à l’aide de simulations de dynamique moléculaire dans deux protéines de la famille des NADPH oxydases (NOX5 humaine et spNOX). Cela a conduit à une première estimation des temps caractéristiques de transfert d’électron dans ces systèmes. D’un point de vue plus général, nos travaux ont révélé la présence d’effets de compensation entre les différents composants du système qui pourraient être à l’origine de la régulation fine de la thermodynamique des transferts d’électron dans les systèmes transmembranaires complexes. Nous avons enfin obtenu des résultats prometteurs sur la modélisation des états rédox de la flavine à l’aide du champ de forces AMOEBA, ouvrant la voie à une amélioration significative des prédictions de potentiels rédox par simulation moléculaire.

D’un point de vue expérimental, différentes formes de la protéine NOX2 ont été produites par des méthodes de biologie moléculaire, dont une espèce chimérique reliant NOX2 à plusieurs de ses partenaires cytosoliques (p67–p47–Rac–NOX2–p22). Il a été montré que dans ce système il est possible d’initier un transfert photo-induit en présence de complexes de ruthénium libre.

Le projet SuperET laisse entrevoir de nombreuses perspectives tant au niveau théorique qu’expérimental. Parmi celles-ci, les plus directes sont les suivantes :

- Amélioration des modèles de NOX2 à l’aide de simulations intégratives en adoptant une description de type ensemble de conformations et en utilisant des données expérimentales pour contraindre les modèles

- Cartographie de la chaîne de transferts d’électron dans d’autres protéines de la famille des NADPH oxydases afin de faire émerger les caractéristiques communes et les différences entre homologues

- Consolidation des techniques de production de systèmes NOX2 et en particulier du système chimérique pour y greffer un complexe de ruthénium à proximité de la flavine, en vue de mesurer la cinétique des transferts d’électron intramoléculaires dans NOX2

Les NADPH oxydases (NOX) sont les seules enzymes connues dédiées à la production d’anions superoxyde pour détruire les pathogènes. Le flavocytochrome b558, cœur catalytique des NOX, est enchâssé dans la membrane des phagosomes et catalyse les étapes ultimes de transferts d’électrons (TE) transmembranaires qui conduisent à la production des anions superoxyde via la réduction à un électron de dioxygène. Les mécanismes moléculaires couplant TE transmembranaires et production de superoxyde, notamment leur caractérisation cinétique et thermodynamique, sont très largement inconnus à ce jour. La première structure au rayons X de la variante NOX5 en 2017 a révélé des indices précieux notamment la localisation de deux hèmes au sein du domaine transmembranaire et des sites possibles de fixation du dioxygène. Dans le projet SuperET, notre stratégie repose sur une synergie expérience/théorie pour d’une part obtenir les premières mesures résolues en temps des transferts d’électron transmembranaires dans la variante NOX2, et d’autre part étudier ces mécanismes de TE grâce à des simulations numériques au-delà de l’état-de-l’art. Les hypothèses mécanistiques issues de la modélisation seront testées en étudiant des mutants à la fois expérimentalement et par simulation, afin d’enrichir le dialogue entre les deux approches.
Expérimentalement, l’initiation de la chaine de transferts d’électrons est un facteur clé qu’il est nécessaire de contrôler pour accéder à la cinétique des différentes étapes. Deux voies seront explorées en parallèle pour y parvenir. D’une part, la radiolyse pulsée picoseconde en condition réductrice sera utilisée pour produire in situ des radicaux carboxyles qui iront réduire la flavine et initier les TE. Cette méthode, qui sera mise en œuvre à l’Institut de Chimie Physique sur le montage ELYSE, présente l’avantage de pouvoir être utilisée directement sur la protéine NOX2 non modifiée. D’autre part, nous mettrons au point des systèmes de NOX2 photoactivables à l’aide de complexes de Ruthénium fixés à la protéine à proximité des cofacteurs rédox dont le rôle sera de donner des électrons à la flavine sous excitation UV-visible. Des mesures d’absorption transitoire résolue en temps (nanoseconde-milliseconde) seront réalisées.
Concernant le volet théorique, nous réaliserons des simulations de dynamique moléculaire des variantes NOX2 et NOX5 insérées dans une membrane peptidique pour en étudier la structure et la dynamique, ainsi que la diffusion de molécules de dioxygène et d’anions superoxyde. Les paramètres thermodynamiques et cinétiques des TE seront obtenus à l’aide de méthodologies éprouvées de type QM+MM dans le cadre de l’approximation de la réponse linéaire. Dans nos simulations, une attention toute particulière sera portée au traitement des interactions électrostatiques, en utilisant le champ de forces multipolaire/polarisable AMOEBA, pour lequel nous développerons notamment des paramètres pour la flavine dans ses différents états rédox.
Notre consortium inclut des experts en simulations de protéines membranaires, de transferts d’électrons, de biochimistes spécialistes des NOX, d’experts en radiolyse pulsée et en photochimie/photobiologie appliquées aux mesures de cinétiques de TE du milieu biologique. Il possède un large panel d’expertises qui, combinées, sont à mêmes de mettre en œuvre les études du projet SuperET et ainsi permettre d’aboutir à la première caractérisation à l’échelle moléculaire des transferts d’électron dans les NOX.