Validation d'un analogue isomorphe fluorescent de la guanosine en tant qu'outil unique pour caractériser site-spécifiquement et dynamiquement les conformations et les interactions moléculaires des G-quadruplexes ARN. – GQfluodynint

LLes quadruplexes de G (GQ) sont des structures non canoniques d'acide nucléique qui se composent d'au moins deux quartets de guanines maintenues par des interactions d'empilement, des paires de bases Hoogsteen et une liaison avec un cation. Les topologies des GQ sont catégorisées en fonction de la direction relative de leurs brins. Les RNA GQ adoptent principalement la topologie parallèle, mais des topologies non parallèles ont aussi été décrites. Les GQ sont largement distribués dans les ARNm et les ARN non codants, où ils régulent l'expression des gènes. In vivo, les ARN GQ seraient dépliés par des protéines de liaison à l'ARN (RBP), telles que l'hélicase DHX36 et la protéine de liaison à l'acide nucléique à doigts de zinc (CNBP). Par conséquent, les ARN GQ sont des structures transitoires converties par les RBP entre leurs états replié et déplié. Pour explorer leur structure et dynamique ainsi que leur interaction avec les RBP, un ensemble limité de techniques est utilisé. Alors que la cristallographie aux rayons X et la spectroscopie RMN peuvent fournir structurales à l’échelle atomique, elles nécessitent des concentrations élevées et ne donnent que des informations dynamiques limitées (rayons X) ou sont limitées par la taille des molécules (RMN). Les techniques de fluorescence sont idéales pour suivre les interactions moléculaires et la dynamique sur une large plage temporelle et à faible concentration, mais souffrent de la nécessité d'introduire des marqueurs externes. De nombreux substituts de purine fluorescents ont été développés, mais déstabilisent généralement les GQ ou sont fortement inhibés. Dans ce contexte, notre objectif est de valider et d'appliquer tzG, un analogue fluorescent isomorphe de G de la famille des isothiazolo [4,3-d] -pyrimidines, développé par un partenaire du projet, comme outil pour caractériser site-sélectivement les conformations, la dynamique et les interactions moléculaires des ARN GQ. Pour atteindre ce but, nous avons réuni un consortium international multidisciplinaire d'experts, tous hautement reconnus dans leurs domaines respectifs. Le projet sera divisé en quatre tâches (WP) et une cinquième organisationnelle (WP0). L'objectif de WP1 est de synthétiser les séquences GQ marquées par tzG nécessaires au projet et de caractériser leurs structures. L'effet de tzG sur la topologie et la stabilité des GQ sera déterminé à l'aide de CD, d'expériences de dénaturation thermique et de spectroscopie RMN en présence d’ions K+ ou Na+. Pour les séquences présentant des spectres RMN bien résolus, la structure 3D sera déterminée pour caractériser finement l'impact de l'insertion de tzG dans les structures des GQ. Dans WP2, nous étudierons de manière approfondie la fluorescence stationnaire et résolue en temps des ARN GQ marqués au tzG en présence d’ions K+ ou Na+. L'interprétation des données à l'aide d'une approche combinée MD / QM devrait fournir une image complète de la photophysique de tzG dans les GQ qui sera essentielle pour rationaliser leurs propriétés spectroscopiques et interpréter leurs changements dans les complexes avec les RBP. Dans WP3, nous validerons tzG comme outil clé pour les ARN GQ en l'appliquant pour déchiffrer le mécanisme de dépliement/repliement des GQ par les protéines DHX36 et CNBP, grâce à une combinaison de RMN, spectroscopie de fluorescence et techniques d’écoulement à flux bloqué. Enfin, en utilisant l'ensemble des données du projet, l'objectif de WP4 sera d'affiner les méthodes et modèles d'interprétation en QM adoptés dans le projet et, de développer un hamiltonien excitonique pour l'étude de la dynamique à l’état excité de systèmes multichromophores. Au final, tzG devrait devenir le premier outil validé pour suivre fidèlement tout G substitué dans les GQ ARN, ce qui conduira à des percées dans la compréhension des propriétés des GQ et des mécanismes d'action des RBP.