Outils peptidiques biomimétiques pour la réticulation de biomatériaux de collagène et le ciblage d'une intégrine liant le collagène pour l’ingénierie tissulaire du cartilage – CARTEGRIN

Photoréticulation des biomatériaux à base de collagène.

La première étape concerne l’optimisation de la méthode de photoréticulation du collagène par exposition aux UV en utilisant des composés photoréactifs. Le collagène est modifié avec un groupement NHS-Diazirine fixé sur les lysines, puis exposé à une lumière UV de 365 nm pour durcir le film de collagène. La concentration de Diazirine, le solvant, la durée d’exposition UV et la distance à la source lumineuse sont optimisés pour pour atteindre des modules de Young comparables à ceux du cartilage sain (2-20 MPa). Cette approche lie de manière covalente les groupements diazirine au squelette du collagène sans modifier la séquence native. L’aspect en surface et la rigidité des films seront analysés par AFM et des tests mécaniques. L’adhérence cellulaire sera aussi évaluée pour vérifier que la photoréticulation n’affecte pas l'affinité des cellules pour le collagène. Des films EDC/NHS serviront de contrôle. Des échafaudages 3D poreux en collagène, obtenus par lyophilisation de suspension, seront réticulés. La taille des pores et leur interconnexion seront étudiées pour assurer la diffusion cellulaire. Nous nous assurerons que cette réticulation empêche la contraction des échafaudages due aux forces cellulaires.

Rôle des récepteurs au collagène dans le comportement des MSCs.

Des THPs qui contiennent un motif GXX’GEX’’ qui se lie aux intégrines α1β1, α2β1, α10β1 ou α11β1 sont synthétisés. Ces peptides seront utilisés pour recouvrir des plaques afin d’étudier la réponse des cellules souches mésenchymateuses (MSCs). Les effets sur l’attachement, la prolifération, la morphologie, et la viabilité des MSCs seront évalués, ainsi que l’expression génique de marqueurs chondrocytaires (SOX9, COL2A1, etc.). L’activation des intégrines sera aussi analysée. Parallèlement, des chondrocytes matures seront cultivés sur ces surfaces THP pour mesurer la production de matrice extracellulaire. Un objectif clé est de cibler l’intégrine α10β1 pour isoler efficacement les MSCs chondrogéniques à partir de tissus adipeux, en utilisant un inhibiteur spécifique (TC-I-15) pour bloquer les autres intégrines. Ce procédé vise à améliorer la différenciation en chondrocytes et prévenir la dédifférenciation fréquente en culture 2D. Nous examinerons également l'effet des récepteurs au domaine discoidin dans la réponse cellulaire. Nous analyserons enfin la production de matrice extracellulaire produite par les cellules différenciées.

Ce projet a permis la mise au point d'une nouvelle méthode de réticulation des éponges de collagènes pour l'ingénierie tissulaire. Cette méthode est basée sur la formation de liaisons covalentes entre les chaines de collagène, par un groupement Diazirine photoréactif.Les groupements Diazirine sont greffés sur les chaines latérales des lysines du collagènes, puis exposées au rayon UV de basse énergie, ce qui ne provoque pas de mort cellulaire. Cette méthode de réticulation permet une augmentation significative de la rigidité et de la stabilité des biomatériaux de collagène, mais n'affecte pas les propriétés biologiques de ceux-ci. Elle est de plus compatible avec l’ensemencement d'éponges de collagène par des cellules souches mésenchymateuses, qui peuvent ensuite se différencier en chondrocytes pour la réparation du cartilage articulaire.

Nous avons mis en évidence l'importance des récepteurs au domaine discoidin dans la différenciation chondrocytaire. Nous explorons désormais le rôle de ces récepteurs dans les pathologies du cartilage comme l'arthrose. Notre objectif est de répondre à des appels à projets pour découvrir de nouveaux THPs qui peuvent lier ces récepteurs avec une forte affinité et spécificité, et ainsi proposer des candidats pour le traitement de l'arthrose.

La mise au point d'une méthode de photoréticulation du collagène par les groupements diazirine offrent de nouvelles possibilités d'utilisation du collagène comme élément de base pour constituer des biomatériaux stables et robustes pour l'ingénierie tissulaire. Cette méthodologie n'est pas limitée à la réparation du cartilage.

L’objectif de ce projet est de développer des biomatériaux de collagène pour l’ingénierie tissulaire du cartilage. A ce jour, les biomatériaux développés pour la médecine régénérative ne réunissent pas à la fois les propriétés mécaniques et biologiques nécessaires pour la réparation du cartilage. En particulier, les interactions cellules-biomatériaux sont souvent inadéquates, entrainant une perte de la fonction et de la survie des cellules ensemencées. Nous proposons d’améliorer ces interactions en fonctionnalisant les biomatériaux avec des peptides triple-hélices (PTHs). Ces PTHs sont des peptides biomimétiques du collagène, qui adoptent sa conformation triple-hélice caractéristique, qui est essentielle à son rôle structurel et biologique. Dans ce projet, des biomatériaux de collagène seront conçus pour accueillir des cellules souches mésenchymateuses (CSMs), promouvoir leur différentiation en chondrocytes et participer à la réparation du cartilage articulaire après implantation au niveau d’une lésion traumatique. Ces biomatériaux prendront la forme d’éponges (des structures poreuses dont l’architecture est contrôlée) conçues pour être greffées sur des lésions de surface du cartilage, ou bien d’hydrogels pouvant être injectés dans des fissures du cartilage de manière non-invasive.
Pour accomplir ces objectifs, nous mettrons tout d’abord au point une nouvelle méthode de réticulation rapide et efficace des biomatériaux de collagène. Celle-ci s’effectuera sous exposition aux UV en présence de groupements photoréactifs, afin d’améliorer les propriétés mécaniques de nos biomatériaux sans modifier la séquence native du collagène. A l’aide de PTHs photoréactifs, nous chercherons notamment à moduler la rigidité des éponges et accélérer la transition sol-gel des hydrogels de collagène. Cette nouvelle méthode de réticulation originale permettra d’obtenir des biomatériaux stables et possédants des propriétés physiques compatibles avec des applications en médecine régénérative, sans altérer les propriétés biologiques naturelles du collagène.
Les PTHs serviront ensuite à modéliser les interactions entre le collagène et les intégrines se liant au collagène (a1ß1, a2ß1, a10ß1 et a11ß1) exprimées à la surface de CSMs. Grâce à des PTHs qui comporteront des séquences identifiées comme ligands pour a1ß1, a2ß1, a10ß1 ou a11ß1, nous déterminerons l’influence de ces intégrines dans l’activité cellulaire des CSMs et dans la chondrogenèse. En particulier, les PTHs permettront de cibler spécifiquement l’intégrine a10ß1 (dont l’expression augmente lors de la chondrogenèse) afin de sélectionner les sous-populations de CSMs qui ont un fort potentiel chondrogénique. Ceci permettra d’élucider le rôle des intégrines se liant au collagène dans le destin des CSMs et fournira de nouveaux outils pour diriger leur différentiation.
Ces PTHs seront ensuite greffés sur des éponges ou incorporés dans des hydrogels, ensemencés à leur tour avec des CSMs. Le rôle de ces PTHs sera de promouvoir l’adhésion de CSMs chondrogéniques, leur différentiation en chondrocytes et la production de matrice extracellulaire spécifique au cartilage in vitro. Les biomatériaux chargés en CSMs seront ensuite introduits dans un bloc ostéochondral de cartilage humain dans lequel une lésion sera induite (sous forme de défaut de surface pouvant accueillir les éponges, ou de fissures dans lesquelles seront injectés les hydrgogels). L’ensemble sera ensuite implanté chez la souris, afin d’évaluer la stabilisation de nos biomatériaux et leur capacité à intégrer le cartilage in vivo.
Les biomatériaux de collagène fonctionnalisés par des THPs et chargés en CSMs différenciées en chondrocytes constitueront d’une part des plateformes pour modéliser le cartilage in vitro ; et d’autre part des dispositifs médicaux pour réparer les lésions de surface (avec des éponges) ou les fissures (avec des hydrogels) du cartilage articulaire, suite à une blessure traumatique et en prévention de l’arthrose.