Systèmes cellulaires hépatiques tout-en-un basés sur des capsules creuses pour des tests de toxicité: une approche d'ingénierie pour une étude quantitative moléculaire et fonctionnelle – REVIL

- Conception et évaluation des protocoles pour déclencher la prolifération d'hépatocytes primaires humains;

-Caractérisation quantitative de la survie, du metabolisme et de la fonction de sphéroïdes d'hépatocytes;

- Evaluation du rôle des signaux environnementaux

- Amélioration du process d'encapsulation

- Développement de techniques d'imagerie volumétrique a long terme

- tests d'hepatotoxicité et caractérisation en profondeur des cultures de lobules artificiels optimaux

Le processus de production des sphéroïdes d’hépatocytes humains primaires (PHH) a été optimisé, depuis la formation de sphéroïdes individuels jusqu’à la génération de centaines d’entre eux en format « batch ». Les conditions favorisant la prolifération des PHH (évaluée par l’incorporation d’EdU, la teneur en ADN, la taille des sphéroïdes et les niveaux d’ATP) ont d’abord été développées en dehors des capsules creuses d’alginate. La formation de sphéroïdes, à partir d’hépatocytes fraîchement isolés ou cryoconservés, s’est révélée hautement reproductible, et les sphéroïdes pouvaient être maintenus pendant au moins trois semaines sans développement de noyaux nécrotiques.

Le transfert dans les capsules s’est avéré problématique en raison de la présence inexpliquée de débris, probablement dus à une interférence entre le calcium présent dans le bain de gélification et les hépatocytes. Pourtant, nous avions optimisé la formation des capsules (article Suire et al.), développé des techniques d’imagerie dédiées à la culture à long terme (article Jana et al.) et des méthodes de tri microfluidique (article Rembotte et al.). Nous avons donc poursuivi nos travaux en dehors des capsules.

Dans ces conditions de culture, les hépatocytes présentaient une polarisation et exprimaient des marqueurs apicaux tels que MRP2. Les sphéroïdes de PHH, qu’ils aient subi ou non une étape de prolifération, ont conservé dans le temps des fonctions métaboliques clés qui, dans le foie natif, sont spatialement zonées le long du lobule. Notamment, l’expression et l’activité des enzymes de métabolisation des médicaments demeuraient inductibles par des inducteurs prototypes, reproduisant ainsi, au moins en partie, l’hétérogénéité métabolique du lobule hépatique. En outre, les sphéroïdes, indépendamment de la prolifération préalable, prédisaient de manière fiable l’hépatotoxicité induite par des médicaments (par exemple, le bosentan ou l’acétaminophène).

Finaliser l’étude précédente par une analyse protéomique et la rédaction d’un article en collaboration avec le consortium.

Trouver un moyen d’appliquer des contraintes mécaniques afin d’étudier une alternative à la zonation hépatique.

Tester nos lobules hépatiques dans des essais d’hépatotoxicité en conditions réelles, dans le but d’identifier de nouvelles molécules actives contre les maladies d’origine hépatique.

Les tests d'hépatotoxicité constituent un défi majeur dans la validation des médicaments. Il existe un besoin urgent de concevoir et de développer des modèles hépatiques humains in vitro fiables qui puissent être éligibles pour l'évaluation de la sécurité des composés chimiques. Bien que les hépatocytes primaires (PHH) restent la référence, le maintien à long terme de PHH viables et pleinement fonctionnels en culture est encore compliqué. Alors qu'une pléthore de nouveaux produits (sur le marché) ou de technologies et protocoles originaux (dans les revues scientifiques) fleurissent, les avancées significatives dans le domaine semblent être entravées par un manque de recherches approfondies, rationnelles et comparatives visant à augmenter la sensibilité, la durabilité et la capacité à haut débit des tests de criblage d’espèces actives. Le premier objectif de REVIL est de fournir une approche intégrée et quantitative permettant un criblage standardisé et fiable de médicaments et produits chimiques toxiques pour le foie à haut débit. Notre stratégie globale est guidée par des considérations physiomimétiques et s'appuie sur des avancées technologiques. Premièrement, sur la base des travaux publiés très récemment et des résultats préliminaires du consortium, nous établirons des protocoles robustes pour récapituler in vitro la capacité proliférative in vivo des PHHs rencontrés dans des situations de régénération du foie. Deuxièmement, nous formerons des sphéroïdes hépatiques à l'aide de notre Technologie de Capsules Cellulaires qui génère des coques sphériques, perméables, creuses enfermant des cellules sans pour autant perturber les interactions cellule-cellule et cellule-matrice. Cette technique polyvalente convient parfaitement à i) la co-culture en 3D, ii) la culture dans des bioréacteurs et iii) l'étude des processus de mécanotransduction. Nous allons donc récapituler de manière unique et contrôlée les signaux environnementaux reçus par les hépatocytes in vivo, y compris les interactions physiques entre les PHHs et les cellules non-parenchymateuses, les signaux de molécules sécrétées, les conditions de physioxie et, peut-être plus important encore, certains signaux mécaniques telles que des forces de compression. Cette stratégie de micro-compartimentation contrôlée devrait permettre, pour la première fois, la formation d'une architecture métabolique de type « zonation » dans des sphéroïdes hépatiques. Notre hypothèse de travail est qu'une telle récapitulation biomimétique devrait générer des systèmes cellulaires présentant une longévité, une fonctionnalité et une sensibilité sans précédent dans les tests de criblage d’espèces actives. Notre consortium interdisciplinaire a été constitué pour rassembler toutes les compétences nécessaires. Il est composé i) d'une équipe de biophysique qui a développé et valorisé la technologie des Capsules Cellulaires, ii) d'une équipe de biologie experte en biologie des cellules du foie et en protéomique assistée par microdissection, et iii) d'une seconde équipe de biologie spécialisée dans les voies de régulation de l'expression des gènes zonés dans les hépatocytes et dans le développement de biothérapies pour les maladies du foie.