Les rétrovirus endogènes et leurs récepteurs : développement de nouvelles solutions de virothérapies ciblées. – EndoRetroTarget

Au cours de nos travaux, plusieurs approches ont été développées pour cibler spécifiquement Env-K, Env-W, HEMO et ASCT2 :

1) Par phage display, identification de ligands de type : nanobodies (S. Moutel et F. Perez) ou alphaReps (P. Minard). Les AlphaReps constituent une classe de petits ligands protéiques constitués d’hélice-alpha répétées. Les phages ont été contre-sélectionnés/sélectionnés sur des cellules contrôles/transfectées pour exprimer la protéine cible. La liaison des ligands est ensuite analysée en cytométrie en flux.

2) ADC— Des anticorps monoclonaux anti-HEMO ont été obtenus chez la souris. De ScFv ont été préparés à partir de ces Ac, puis fusionnés à des domaines Fc humains (IgG2 humain, pFUSE, InvivoGen), et couplés au MMAE (Mono-Méthyl Auristatine E) via un groupement maleimide, un ratio drogue/anticorps compris entre 8-10 a été obtenu. L’activité cytolytique des ADC a été évaluée in vitro dans des cellules transfectées ou non par HEMO et dans des lignées tumorales.

3) Application des ligands à la préparation de virus oncolytiques (OVs) :

Génération de pseudotypes et de virus réplicatifs de type VSV re-dirigés via la substitution de VSV-G par :

a) des ligands obtenus en phage display et des ScFv obtenus par vaccination fusionnés avec la protéine H de la rougeole et exprimés en présence de la protéine F ; des ligands/ScFv fusionnés avec le domaine transmembranaire de la protéine humaine PDGFR. Evaluation par 2 types de test : (i) des expériences de fusion cellulaire via la co-culture de cellules exprimant la cible (Env ou ASCT2) et un fragment de la beta-Gal avec des cellules exprimant le ligand/ScFv fusionné avec la protéine H + F ou avec PDGFR et le fragment complémentaire de la beta-Gal, (ii) des expériences de pseudotypage en suivant l’expression de la GFP par microscopie à épifluorescence ou par cytométrie en flux.

b) le récepteur (R) endogène humain de Env-K (VSV-R-Env-K) pour cibler les cellules Env-K positives (« virus inverse »). Evaluation in vitro et in vivo (voir ci-dessous).

c) Env-W (syncytine-1) pour cibler les cellules ASCT2 positives. Evaluation in vitro de l’infection (GFP) et de la lyse (mesure de l’ATP intracellulaire, Promega) induits par VSV-Syn dans des cellules transfectées, des lignées tumorales, des sphéroïdes, des organoïdes et des tranches de tumeurs primaires/PDX (tranches de 300 micromètres d’épaisseur réalisées au vibratome). Evaluation in vivo de VSV-Syn dans des PDX

4) Application des ligands à la préparation de CAR : préparation d’un vecteur rétroviral constitué d’un nanobody anti-Env-K fusionné avec des domaines charnière et transmembranaire CD8, du domaine co-stimulateur 4-1BB et du domaine de signalisation CD3z (CAR de 2d génération). Des CAR anti-Env-K ont été transduits dans des lymphocytes T CD8 de donneurs sains, puis leur activité cytolytique a été évaluée in vitro en présence de cellules transduites avec Env-K et de cellules contrôles.

Ciblage de 3 protéines d’enveloppe de ERV : HEMO, Env-K et Env-W :

>10 ScFv anti-HEMO obtenus chez la souris ont été utilisés pour préparer (i) des ADC et (ii) des pseudotypes re-dirigées en fusion avec la protéine H de la rougeole et en présence de la protéine F. Les ADC anti-HEMO induisent la mort des cellules transfectées avec HEMO mais pas de lignées tumorales évaluées. Les pseudotypes redirigés infectent les cellules transfectées avec HEMO mais pas les lignées tumorales testées.

Les criblages par phage display ont conduit à l’identification de >10 nanobodies anti-Env-K, 3 alphaReps anti-Env-K, et 2 alphaReps anti-Env-W. Ils lient les cellules transfectées avec les Env ciblées mais ne reconnaissent pas les lignées tumorales évaluées. Ces ligands ont été utilisés pour préparer des pseudotypes re-dirigées en fusion avec la protéine H de la rougeole + F ou en fusion avec PDGFR. Les pseudotypes anti-Env-K infectent les lignées Env-K stables, mais pas les lignées tumorales testées. Nous n’avons pas obtenu de pseudotypes infectieux contre Env-W (alphaRep-H + F). Un CAR a également été préparé à partir d’un nanobody anti-Env-K, aucune activité cytotoxique des cellules CAR-T co-cultivés avec des cellules Env-K positives n’a été observée.

Nous avons obtenu des virus réplicatifs « inverse » (VSV-R-Env-K) pour cibler Env-K. Ces virus infectent spécifiquement les lignées Env-K stables. Lors de leur évaluation in vitro dans des lignées tumorales et in vivo des PDX, une infection faible comprise entre 1% et 2% des cellules a été mesurée.

Ciblage de ASCT2, le récepteur endogène de Env-W (syncytine-1) :

La protéine VSV-G a été remplacée par Env-W pour préparer des pseudotypes et des virus oncolytiques réplicatifs (VSV-Syn). L’infection, la fusion et/ou la lyse efficace des cellules ASTC2 positives a été observée in vitro dans des lignées tumorales, des sphéroïdes, des organoïdes issus de métastases hépatiques (cancers du pancréas) et des tranches épaisses de tumeurs (tumeurs primaires et PDX). Alors que les cellules dendritiques et les syncytiotrophoblastes sont les cellules saines dans lesquelles ASCT2 est le plus exprimé, aucune infection de VSV-Syn n’a été observée dans des PBMCs et des cellules placentaires normales. Un brevet a été déposé (octobre 2023) et un article est en préparation (Tran et al.).

Les OV VSV-Syn sont actuellement testés chez des souris immunodéficientes portant des xénogreffes tumorales dérivées de patients (PDX). Plusieurs PDX présentant les niveaux d'expression les plus élevés de ASCT2 (ainsi que les protéines d'enveloppe HERV-K, voir ci-dessus) et provenant de plusieurs types de cancer ont été sélectionnées et sont en cours d’évaluation chez des souris immunodéficientes (NSG). Les souris sont traitées par injection intra-tumorale répétées ou en I.V. avec les virus oncolytiques VSV-Syn. Nos premiers résultats indiquent une infection du PDX par le VSV-Syn et une réplication virale avec formation de syncytia.

Ce programme de recherche a conduit à l’identification de ligands protéiques contre 3 protéines d’enveloppe de rétrovirus endogènes : Env-K, Env-W et HEMO. Ces ligands reconnaissent leurs cibles dans leur conformation native à la surface des cellules transfectées. Afin de détecter et d’éliminer les cellules tumorales qui expriment les Env à un niveau plus bas, les ligands seront multimérisés en homo ou hétéro-multimères (ie. ligands qui reconnaissent des domaines différents de la même protéine cible).

La protéine Env-K a également été ciblée via son récepteur endogène (R) exprimé à la place de VSV-G dans des pseudotypes et des virus réplicatifs, VSV-R-Env-K. Un PDX issu de cancer pédiatrique dans lequel Env-K est exprimé a été greffé à des souris. VSV-R-Env-K n’induit pas de régression tumorale et infecte entre 1 et 2,5% des cellules tumorales greffées.

L’évaluation de l’infectivité du virus réplicatif VSV-R-Env-K sera poursuivie, notamment in vitro via la préparation de cellules et d’organoïdes issus du PDX et in vivo dans des souris immunocompétentes.

Enfin, l’utilisation de Env-W (syncytine-1) pour cibler son récepteur ASCT2 a conduit à la mise au point d’un virus oncolytique re-dirigé VSV-Syn dont l’efficacité a été démontré sur un large panel de lignées tumorales, PDX et organoïdes qui expriment ASCT2.

Comme attendu, du fait de sa sensibilité aux réponses interférons, VSV-Syn infecte de façon sélective les cellules cancéreuses.

L’expression de Env-W à la surface des cellules infectées par VSV-Syn entraîne leur fusion avec les cellules voisines non-infectées exprimant ASCT2, ce qui conduit à la formation de structures cellulaires multinucléés (syncytia) connues pour générer une mort particulièrement immunogène.

Les virus VSV-Syn seront évalués prochainement dans des souris immunocompétentes greffées avec des cellules tumorales murines syngéniques, afin d’évaluer également les réponses immunes induites par VSV-Syn nécessaires à l’élimination tumorale.

En raison de la forte expression de sa protéine cible dans certains cancers, de sa sensibilité à l’interféron, ainsi que de ses propriétés de fusion, nous avons l’objectif de poursuivre le développement de VSV-Syn jusqu’au stade clinque. VSV-Syn étant capable de reconnaître aussi bien ASCT2 canin et humain, il sera prochainement évalué via des injections intra-tumorales chez le chien pour des tumeurs mammaires et sous-cutanées (clinique vétérinaire OncoVet à Lille). Ce projet de médecine vétérinaire porté conjointement par l’UMR9196 et Viroxis a fait l’objet d’un financement de l’ANR (ANR2023 CE18-OVICAN).

Les éléments d'origine rétrovirale, ou HERVs (human endogenous retroviruses), représentent une proportion importante du génome humain. Globalement réprimés en raison de leur origine infectieuse, ils peuvent s’exprimer dans des contextes normaux, notamment la placentation, et/ou pathologiques. Dans les cancers, l'hétérogénéité épigénétique peut entraîner l'activation d'un ensemble de HERVs, qui peuvent à leur tour être associés à l'expression aberrante d'oncogènes via l'utilisation de leurs régions promotrices (LTR, long terminal repeats). Bien qu’issues d'infections intégratives survenues il y a des dizaines de millions d'années, certains gènes de HERV codent encore pour des protéines d'enveloppe fonctionnelles, dont la capacité à se lier à un récepteur endogène -voire de réaliser une fusion cellulaire- a été maintenue. Au cours de nos travaux portant sur les protéines d’enveloppe des HERVs, nous avons identifié plusieurs récepteurs et obtenus des anticorps spécifiques. Ces ligands sont utilisés pour développer de nouveaux outils thérapeutiques qui ciblent les protéines d’enveloppe de HERVs tumeur-spécifiques, HERV-K et HEMO. Des pseudotypes ont été « re-ciblés » grâce à l’expression de 2 protéines de la rougeole, la protéine F sauvage et la protéine H fusionnée à des ligands de HERVs. En partenariat avec VIROxIS, nous proposons de produire des lots précliniques de virus oncolytiques de type virus de la rougeole ou virus de la stomatite vésiculaire (VSV) re-ciblés contre les HERV-K et HEMO et d'évaluer leur activité contre des tumeurs humaines issues de cancers digestifs, gynécologiques et pulmonaires greffables chez la souris (PDX, patient derived xenograft). Le re-ciblage des virus oncolytiques a pour objectif de réduire les risques d'infection/élimination des cellules non cancéreuses. En outre, l’efficacité des virus oncolytiques re-ciblés pourra être accrue grâce à des approches bispécifiques, combinant un récepteur et un anticorps liant l'enveloppe de l’HERV ciblé.
Au cours de nos études, nous avons obtenu l’infection de près de 50 % des cellules positives pour l’enveloppe de HERV-K grâce à des pseudotypes exprimant la protéine H fusionnée au récepteur de HERV-K et des pourcentages moindres pour des pseudotypes H fusionnée avec les scfv anti-HERV-K ou anti-HEMO. C’est pourquoi, ce programme de recherche débutera par la préparation de lots pré-cliniques de virus oncolytiques H fusionnée au récepteur de HERV-K, tandis que de nouveaux anticorps anti-HERV-K et anti-HEMO seront sélectionnés à partir de banques d’anticorps humanisés. Nous disposons actuellement de plus de dix anticorps contre les deux protéines d'enveloppe ciblée dans ce programme et un nouveau criblage de banques d'anticorps a d’ores et déjà débuté en collaboration avec l'institut Curie. La validation des anticorps anti-HERVs sera réalisée à la suite de leur évaluation dans des souris PDX sous le format anticorps drogue-conjugué (ADC). Les anticorps présentant la meilleure activité anti-tumorale seront fusionnés à la protéine H pour être appliqués aux virus oncolytiques. En parallèle, leur activité anti-tumorale sera également évaluée sous la forme de lymphocytes T « chimeric antigen receptor » (CAR). Ce programme de recherche vise la mise au point de nouvelles thérapies contre le cancer basées sur l’utilisation des récepteurs de HERVs et d’anticorps spécifiques, en particulier des virus oncolytiques re-ciblés mono ou bispécifiques jamais développés jusqu’à présent, qui en raison de leur caractère réplicatif pourraient éliminer efficacement les tumeurs solides.