Délivrance des vesicules extracellualires grâce à la fusion des membranes – EVfusion

Dans les 10 dernières années, les vésicules extracellulaires (VE), y compris les exosomes, sont apparues comme un vecteur important de communication intercellulaire. Les VE permettent le transport de lipides, d’acides nucléiques et de protéines d’une cellule donneuse vers une cellule acceptrice. Les VE sont associées à plusieurs fonctions physiologiques et maladies. Aujourd'hui, la biologie des VE est un sujet de recherche intense, qui promet de révolutionner la recherche translationnelle par le développement de « VE-mimétiques » conçues pour une administration ciblée de produits thérapeutiques. Des progrès considérables ont été réalisés afin de comprendre les mécanismes qui régulent la sécrétion des VE. Cependant, notre connaissance de l'absorption des VE et de la livraison du contenu dans les cellules acceptrices est encore très limitée.
Nous proposons une combinaison d'expériences de biologie cellulaire couplées à des études in vitro et à la microscopie électronique par réplique métallique (PREM) pour étudier la fusion des VE avec leurs membranes cibles.
Premier but : Nous capitaliserons sur nos essais cellulaires déjà publiés et des méthodes d'imagerie (optique et électronique) pour 1) caractériser l'absorption et la livraison du contenu des VE 2) identifier de nouvelles protéines impliquées dans le processus de fusion, 3) déterminer les paramètres tels que la taille/le type de cargo qui conditionnent la livraison des VE par fusion.
Nous testerons plusieurs protéines candidates qui sont suspectées de contrôler l'absorption et la livraison des VE. Nous concentrerons nos travaux sur une famille de protéines appelées hEnvs, issues de protéines virales ancestrales mais intégrées dans le génome humain, ainsi que sur les protéines IFITM1 et 3. Les hEnvs pourraient être impliquées dans la délivrance des VE en fonction du pH, tandis que les IFITM1 et 3 inhiberaient la délivrance du contenu des VE. Les principaux acteurs des voies d'endocytose (clathrine, dynamine, cavéoline) seront également testés. Nos essais seront complétés par des analyses morphologiques (microcopie fluorescente et microscopie électronique classique), afin d'analyser la distribution des marqueurs EV dans les cellules.

Deuxième but : Nous développerons de nouveaux tests in vitro basés sur la fluorescence afin d’imager la fusion membranaire des VE en temps réel et sur molécule unique, couplés mais à de la microscopie corrélative (EM/Fluorescence) pour capturer tous les états intermédiaires de la fusion.
Notre objectif principal est d'établir que la fusion membranaire est le mécanisme responsable de la livraison du contenu des VE. Ce mécanisme n'a jamais été prouvé jusqu'à présent. Notre travail fournira une avancée significative dans la compréhension du mécanisme de livraison (fusion). Nous adapterons un essai acellulaire qui utilise des feuillets de membranes plasmatiques (PM) acceptrices couplées à une expérience de suivi de diffusion de particules isolées. En utilisant la microscopie fluorescente, nous suivrons en temps réel et sur des VE uniques la diffusion des VE, le docking et les réactions de fusion.
De plus, le même essai in vitro sera utilisé pour visualiser directement le processus de fusion au niveau ultra-structural. Nous proposons d'imager les échantillons par microscopie électronique à réplique de platine (PREM). Les EVs seront chargées au-dessus des feuillets de PM déposées et fixées. Dans un premier temps, nous espérons disséquer le phénomène de fusion puis nous souhaitons capturer tous les états intermédiaires de la fusion (y compris le pore de fusion lui-même) en fixant rapidement les échantillons à différents moments et dans différentes conditions.