Diversification adaptative des orchidées mouches comme modèle pour étudier la spéciation écologique et les radiations adaptatives – DiversiFly

L’idée de base était de se focaliser dans un contexte spatial où les aires de distribution géographique des espèces du groupe Ophrys insectifera se chevauchent : dans les Grands Causses pour Ophrys insectifera et Ophrys aymoninii et dans le Nord de l’Espagne (pour le coup en Catalogne) pour Ophrys insectifera et Ophrys subinsectifera (10 localités). A ces deux zones, nous avons ajouté deux localité « contrôle », géographiquement intermédiaire (7-Versols-Et-Lapeyre) qui est située dans une zone où seul O. insectifera est présent et 12-Rodome.

Sur chaque localité, les individus ont été :

- Géolocalisés et marqués. Les localités ont ensuite été visitée 2 fois par an : au moment de la floraison (mai) et au moment de la fructification (juillet) afin d’estimer la probabilité de survivre (ou en tout cas, de refleurir) et de se reproduire (ou en tout cas, de produire des fruits).

- Chaque individu a été étudié au niveau de caractéristiques morphologiques en lien avec l'appareil végétatif et les structures reproductives (fleurs).

- La fleur mesurée a aussi été photographiée de façon standardisée afin d’étudier d’autres traits floraux ainsi que la coloration.

Pour les études génomiques et transcriptomiques, 2 bractées ont été prélevées pour l'extraction de l’ADN et la fleur mesurée a été prélevée et stockée dans une solution de RNAlater à 4°C pour l' extraction de l’ARN.

- Une deuxième fleur, en général celle du dessus, a aussi été prélevée et immergée dans de l’hexane jusqu’à analyse du bouquet d’odeur en chromatographie en phase gazeuse couplée à de la spectrométrie de masse (GC-MS).

Les analyses de génomique des populations ont ensuite été effectuées sur la base d’un génotypage ‘nGBS’ (pour normalised Genotyping By Sequencing). Les transcriptomes floraux ont quant à eux été séquencés en Illumina.

C’est au final 262 individus d’Ophrys en provenance de 12 populations qui ont été analysés dans le cadre de cette étude, nous permettant ainsi de générer un jeu de données multi-omique inédit pour ce système.

L’étude de génomique des populations menée là où les aires de distribution des espèces du groupe d’O. insectifera se chevauchent deux à deux a ainsi permis de mettre en évidence des patrons indiscernables avec des approches de séquençage plus traditionnelles . Ainsi, il apparaît qu’en France, O. aymoninii, endémique des Grands Causses est déjà bien différenciée des d’O. insectifera duquel elle il est souvent sympatrique et syntopique. L’absence de signe d’hybridation récente plaide en la faveur d’un isolement reproductif déjà bien établi. De manière intéressante, nous avons cependant confimé qu’O. aymoninii, s’hybride un autre Ophrys phylogénétiquement plus éloigné mais avec qui il partgerait son pollinisateur Andrena combinata : la forme locale tardive d’un Ophrys de la mouvance litigiosa/virescens. La situation est au demeurant bien plus confuse en Espagne où bien que morphologiquement assez distincts, les Ophrys subinsectifera pourraient en fait former un essaim hybride plus ou moins généralisé avec les populations locales d’O. subinsectifera.

Les approches intégratives nous ont notamment permis de mettre en évidence un îlot de divergence située sur le chromosome 10, jusqu’alors inconnu chez Ophrys. Cette région comprend plusieurs SNPs outliers dont certains correspondent à des gènes potentiellement impliqués dans le développement floral (LFY) et peut-être la production d’odeurs (SAT pour Stemmadenine O-acetyltransferase et MAS pour Malate synthase) ? Ces gènes apparaissent par ailleurs comme différenciellement exprimés entre espèces ce qui soutient un probable impact fonctionnel. D’autres candidats au phénotype floral ont par ailleurs pu être mis en évidence dont DFR1 (coloration) CCR (pour Cinnamoyl-CoA reductase) et des paralogues de SAD (odeur, bien connus chez Ophrys). Des ACP locales ont ensuite pointé que cette semblait au final plus similaire aux Ophrys du groupe sphegodes qu’à ceux du groupe insectifera chez O. aymoninii. Nous émettons désormais l’hypothèse que cette région génomique, pourrait correspondre à une région introgressée, potentiellement adaptative et peut-être protégée des effets de la recombinaison en raison d’une variation structurale (inversion chromosomique ?).

Morphométrie et coloration - L’exploitation des photographies calibrées prises en condition de terrain (morphomologie, coloration) a confirmé que toute information quantitative qui en dérive peut-être très informative. En cela, elle complémente avantageusement les informations prises directement sur le terrain notamment la morphométrie 1D faite au réglet ou au pied à coulisse. Pour effectuer un phénotypage plus exhaustif, plus s’affranchir du biais expérimentateur et produire des données pérennes tout en étant non-destructif, l’idée est cependant désormais de se tourner vers l’utilisation de scanners 3D portatifs pour sauvegarder une copie numérique intégrale de chaque plante.

Génotypage – En révélant des îlots de divergence pertinents, l’approche nGBS a donné des résultats « inespérés » compte-tenu de la densité en marqueurs relativement faible sur un si gros génome. L’idée est désormais d’aller plus loin avec des approches de reséquençage de génome complet pour affiner ces résultats. En plus, nous envisageons aussi le séquençage, l’assemblage et l’annotation de nouveaux génomes de référence à une échelle réellement chromosomique.

Transcriptomique – Là encore, la « prise de risque » s’est avéré payante. Au début du projet, peu de sous-traitant étaient confiant à l’idée d’obtenir de l’ARNm en quantité et en qualité à partir de fleurs stockées dans du RNAlater dans des conditions de terrain. Au final, le taux d’échec dans la préparation des banques a été très faible et nous avons pu pour la première fois faire le lien entre le compartiment transcriptomique et les autres niveaux d’intégration chez en population naturelle chez Ophrys.

Métabolomique – Bien qu’a priori moins onéreuse et moins prompte à capter les molécules « parasites » de l’environnement, l’immersion dans l’hexane a donné des concentrations faibles et nous obligeait à sacrifier une fleur par individu. Dans l’avenir, nous envisageons d’utiliser préférentiellement des fibres SPME pour analyser les bouquets d’odeur florale.

Développer une recherche intégrative permettant d’élucider à la fois les liens entre génotypes, phénotypes et fitness et les bases génomiques de la variation constitue un défi majeur dans notre compréhension de la spéciation et de l’émergence de la biodiversité. Avec DiversiFly, je propose de mettre en place ce type d’approche en générant, analysant et comparant des données phénotypiques (morphométrie, coloration, odeur), génomiques et écologiques sur des orchidées du genre Ophrys. Ce genre présente un des taux de diversification les plus élevés et les zones hybrides formées dans la nature par certaines de ses espèces en font un modèle prometteur pour appréhender les causes des radiations adaptatives: phénomènes de diversification intenses et rapides en réponse à des pressions de sélection d’ordre écologique. Par ses approches, DiversiFly vise notamment à combiner des études à des échelles évolutives différentes, en s’intéressant à des espèces endémiques et menacées.

Dans une première partie, l’étude parallèle de deux zones hybrides nous permettra de déterminer quels sont les traits phénotypiques (morphologie, coloration, odeurs) impliqués de façon prépondérante dans l’adaptation et l’isolement reproductif au sein du clade O. insectifera. Via des analyses de clines, de recherches d’outliers et des études d’association, nous confronterons ensuite les données phénotypiques et génomiques (transcriptomes et génotypages par séquençage) afin de rechercher les bases génomiques des traits d’intérêt. Les liens entre phénotypes et fitness individuelle seront évalués sur des traits d’histoire de vie en lien avec le succès reproductif et la survie des individus. Dans la mesure où tous les individus seront marqués, les phénotypes et la fitness seront mesurés tous les ans, et ce sur la durée du projet afin d’étudier leur stabilité.

Dans une deuxième partie, nous faisons le lien entre les échelles micro- et ‘macro-‘ évolutive en travaillant sur l’ensemble du genre Ophrys. Nous utiliserons des transcriptomes floraux sur des espèces représentatives de la diversité du genre afin d’identifier les gènes qui façonnent le phénotype floral si particulier des Ophrys. En suivant une approche comparative, nous nous baserons ainsi aussi bien sur l’étude des séquences que sur les niveaux d’expression des gènes.

Nos résultats auront un impact significatif dans le domaine de l’écologie et de l’évolution en contribuant à l’émergence d’un nouveau modèle plante, à génome complexe pour étudier la spéciation et la diversification évolutive de plus grande ampleur. Ils contribueront également à des disciplines telles que la génomique, la biologie de la conservation, la systématique et la taxonomie. Nous croyons également qu’avec ses fleurs mimant des insectes, Ophrys est un excellent modèle pour la communication scientifique à destination du grand public.