Contexte en oxygène et origine relative des voies de biosynthèse des quinones – QUINEVOL

Une combinaison de méthodologies bioinformatiques et expérimentales a été employée.

1. Annotation génomique à grande échelle des voies de biosynthèse des quinones

- Utilisation de bases de données de génomes bactériens publics de haute qualité issus de la Genome Taxonomy Database (GTDB) ou du NCBI, représentant la diversité bactérienne connue.

- Recherche de similarité : Identification des gènes impliqués dans les voies de biosynthèse des quinones (ubiquinone/UQ, ménaquinone/MK, plastoquinone/PQ, rhodoquinone/RQ) à l’aide de profils de modèles de Markov cachés (HMM) développés au sein de l'équipe.

- Critères de présence des voies : Une voie est considérée comme présente si un nombre minimal de gènes requis pour sa biosynthèse est identifié dans un génome (par exemple, 3 protéines pour la voie PQ, 5 pour la voie UQ dépendante de l’oxygène, etc.).

2. Analyse phylogénétique et comparative

- Cartographie des voies de biosynthèse : Superposition des données d’annotation des voies de sur un arbre phylogénétique bactérien pour visualiser la distribution des voies de biosynthèse et identifier des mécanismes évolutifs à l'origine de la diversité des voies (pertes, gains, transferts horizontaux).

- Analyses phylogénétiques pour déterminer l'origine des gènes des voies.

- Corrélation avec les métabolismes énergétiques : Étude des liens entre la diversité des quinones et les adaptations métaboliques (aérobie/anaérobie, utilisation de différents donneurs/accepteurs d’électrons).

3. Caractérisation biochimique des quinones produites

- Extraction des quinones à partir de cultures bactériennes, utilisation de la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS) pour identifier et quantifier les quinones produites par différentes espèces bactériennes.

4. Validation fonctionnelle des enzymes

- Expression hétérologue : Clonage et expression de gènes candidats dans des souches modèles (mutants de Escherichia coli) pour confirmer leur rôle dans la biosynthèse des quinones.

Parmi les résultats majeurs, nous pouvons citer les éléments suivants dont les détails sont discutés dans quatre articles scientifiques et un article "pre-print" :

- l'obtention d'un outil d'annotation dans les génomes des voies de biosynthèse des quinones (ubiquinone UQ, ménaquinone MK Men et futalosine, plastoquinone PQ) qui a été constamment étoffé et amélioré par une combinaison d'approches de génomique comparative, phylogénétiques et expérimentales

- l'élucidation du scénario évolutif de diversification des étapes d'hydroxylation des voies de biosynthèse O2-dépendante et O2-indépendante de l'ubiquinone

- la mise en évidence de la forte conservation chez les Pseudomonadota de la régulation par FNR (un régulateur majeur de l'anaérobiose) de la voie de biosynthèse O2-indépendante de l'UQ

- la mise en évidence du lien entre répertoire en quinones des Pseudomonadota avec leur métabolisme respiratoire, offrant une réponse à un des questionnements majeur du projet et ouvrant de riches perspectives sur l'étude de la diversification du métabolisme procaryote à la lumière des quinones

- le scénario global de l'évolution du répertoire en quinones chez les Pseudomonadota, avec l'ancestralité désormais démontrée de la voie UQ et des acquisitions latérales secondaires de la voie Men de la MK

- l'implication d'une enzyme FMO (flavin mono-oxygenase) nécessitant de l'O2 pour produire de la plastoquinone chez les Cyanobactéries photosynthétiques, et la démonstration de son acquisition à partir de FMO de la voie UQ des Pseudomonadota

- la découverte d'une nouvelle lignée bactérienne contenant de l'UQ et possédant la voie O2-indépendante, ce qui après analyses phylogénétiques, permet d'avancer dans le temps l'origine de la voie O2-indépendante de production de l'ubiquinone, et de proposer que celle-ci serait bien antérieure à la voie de biosynthèse O2-dépendante

Les deux derniers points apportent des éléments de réponse à des questions majeures du projet sur l'ordre d'apparition respectif des voies de biosynthèse des quinones : UQ versus PQ (du moins dans sa version contemporaine), et UQ O2-dépendante versus O2-indépendante.

- une vision globale de la distribution des voies de biosynthèse des quinones chez les bactéries

- l'extraction de données issues de la littérature sur la nature et les longueurs de chaînes des quinones pour des milliers d'espèces bactériennes par des approches de fouille de texte (text mining)

- la découverte en collaboration avec le Dr. Felix Elling (U. Kiel, Allemagne) d'une nouvelle quinone de haut potentiel chez les Nitrospirota, la méthylplastoquinone, ainsi que la caractérisation génomique et expérimentale des enzymes impliquées dans la nouvelle voie de biosynthèse correspondante

Les découvertes réalisées au cours du projet QUINEVOL ont permis d'ouvrir de nombreuses perspectives qui seront explorées dans un projet nouvellement financé par l'ANR, le projet PRCI ToLQuin.

Notamment il est apparu 1) que des quinones de haut potentiel (méthylplastoquinone et ubiquinone) sont plus représentées qu'il n'était attendu dans l'arbre du vivant, 2) que certaines lignées ne sont pas pourvues de quinones, 3) que le répertoire en quinones semble être associé à la diversification du métabolisme bactérien.

En particulier, ce nouveau projet s'attellera à explorer en profondeur les étapes encore non caractérisées des voies de biosynthèse des quinones, à faire l'inventaire des quinones dans des lignées de bactéries et d'archées cultivées au laboratoire, tout en explorant leur diversité dans des échantillons environnementaux. Au final, cette nouvelle vue de la diversité des quinones dans l'arbre du vivant permettra de répondre au rôle de la diversification des quinones au cours de l'évolution du métabolisme bactérien et archéen dans un contexte biogéochimique.

L’augmentation des niveaux de dioxygène sur Terre lors du « grand choc oxydatif » (GCO) a conduit au passage de conditions globalement réductrices à oxydantes et a bouleversé les processus bioénergétiques des microorganismes ancestraux. Au cœur de ces processus, les quinones, molécules quasi-ubiquitaires du Vivant, ont curieusement été peu étudiées dans le contexte du GCO. C’est ce que nous proposons d’étudier avec le projet QUINEVOL.
Les quinones sont centrales aux processus bioénergétiques des cellules, et le GCO les a soumises à de fortes contraintes évolutives. En effet, les quinones dites à bas potentiel présentées comme ancestrales et retrouvées dans une grande diversité d’organismes ne sont pas adaptées à des concentrations environnementales élevées d’O2 car elles sont sensibles à l’oxydation. L’apparition de nouvelles quinones dites à haut potentiel (QHP) est vue comme une réponse à l’oxygénation de la Terre. Deux clades se démarquent par leur adoption de ce type de quinones, et par leur succès évolutif dans des environnements riches en O2 : les Cyanobactéries et les Protéobactéries.
Les Cyanobactéries sont considérées comme responsables du GCO via la photosynthèse oxygénique qui libère de l’O2 et utilise une QHP, la plastoquinone (PQ). Jusqu’à présent, parce que la synthèse de la QHP des Protéobactéries (ubiquinone, UQ) nécessitait de l’O2, les Cyanobactéries oxygéniques étaient vues comme antérieures aux Protéobactéries.
Or des découvertes récentes de notre équipe invitent à ré-évaluer le scénario d’apparition des QHP et des organismes qui les ont adoptées. 1) Nous avons découvert, chez de nombreuses Protéobactéries, une voie de synthèse de l’UQ qui ne nécessite pas d’O2 et intervient chez certaines dans des processus anaérobiques. 2) Nous avons montré qu’une des étapes manquantes de la synthèse de PQ dépend de la présence d’O2. Des incertitudes sur le tempo de l’oxygénation de la Terre et la découverte de nouvelles lignées dont des Cyanobactéries non-oxygéniques alimentent la question de l’ordre et du contexte en O2 d’apparition des Cyano- et des Protéo- bactéries.
Avec QUINEVOL, nous proposons d’entreprendre une analyse évolutive inédite des voies de synthèse des quinones qui permettra d’éclairer l’adaptation des microorganismes ancestraux et de leurs processus bioénergétiques face à l’oxygénation de la Terre. Nous proposons de 1) créer des outils d’annotation des voies des quinones dans les génomes, 2) revisiter la division fonctionnelle classique faite entre quinones à bas et haut potentiel vis-à-vis de leurs conditions environnementales d’utilisation, 3) élucider le contexte d’apparition de l’UQ chez les Protéobactéries et de PQ chez les Cyanobactéries, et 4) reconstruire un scénario évolutif global d’émergence de ces quinones dans un contexte de montée des niveaux d’O2 sur Terre.
Nous proposons une combinaison originale d’approches phylogénomiques et expérimentales. a) Les outils d’annotation développés seront validés par des données extraites en masse de la littérature et par la caractérisation expérimentale de quinones dans des lignées inexplorées. Cela permettra la mise à jour du répertoire en quinones du « nouvel arbre du Vivant » tout en proposant des enzymes candidates pour des étapes manquantes dans la synthèse des quinones. b) L’analyse de données environnementales de distribution des quinones et de données originales de métagénomique et de lipidomique permettront de ré-évaluer le rôle écophysiologique des différentes quinones. c) Un scénario global d’origine des quinones sera créé en combinant phylogénie moléculaire classique et utilisation des évènements de transferts de gènes comme outils de datation moléculaire. Par ses approches originales, le projet QUINEVOL apportera un éclairage nouveau sur les adaptations bioénergétiques liées à la montée des niveaux d’O2 sur Terre.