Découverte et ingénierie de la diversité moléculaire des alcaloïdes azacyclique issus de la voie NRPS chez des bactéries – NRPSBacAza

Nous utiliserons une approche multidisciplinaire, faisant appel à la microbiologie, la chimio-informatique, la métabolomique non ciblée, la biochimie, la biologie synthétique et la chimie analytique, pour atteindre nos objectifs.

Cette étude élucide la biosynthèse de l'azétidomonamide A, un cyclocarbamate produit par P. aeruginosa. Les étapes post-NRPS/BVMO comprennent une cétoréduction, une déshydratation et une hydroxylation stéréospécifique. Une synthèse in vitro impliquant toutes les enzymes de biosynthèse a permis la production d'azétidomonamide A. Des analyses bio-informatiques, structurales et mécanistiques de la déshydratase de type domaine de condensation ont été réalisées, approfondissant notre connaissance sur les fonctions non-canoniques des domaines NRPS.

Deuxièmement, la voie de biosynthèse des pyrrolizwillines a été identifiée chez X. hominickii. Une hydrolase clé, située au point de ramification et qui convertit l'intermédiaire de la voie commune, le pyrrolizixénamide, en pyrrolizwilline, a été caractérisée biochimiquement et structuralement. Un point remarquable est la formation des pyrrolizwillines qui nécessite une étape de condensation non-enzymatique avec un métabolite issu d’une voie du métabolisme primaire.

Des études antérieures ont montré que les voies des APs chez les bactéries présentent généralement une grande plasticité métabolique, grâce à la promiscuité des substrats des domaines d'adénylation du NRPS. Ainsi, une stratégie de coexpression a été appliquée à l'ingénierie de nouveaux produits d’AP chez E. coli. Le couple NRPS/BVMO impliqué dans la biosynthèse de pyrrolizixénamide a été coexprimé avec AzeJ, une enzyme de la voie de l'azétidomonamide qui produit le précurseur du NRPS à quatre chaînons (c'est-à-dire l'acide azétidine 2-carboxylique (AZC)). Cela a permis la production de pyrrolixénamides incorporant de l'AZC, inédits dans la nature.

Ces travaux approfondissent la compréhension actuelle de la plasticité métabolique et de la biosynthèse des APs bactériens, et soulignent l'importance des réactions non-enzymatiques dans la diversification chimique de ces voies. De plus, nous révélons des informations structurales et mécanistiques sur la fonction non-canonique des domaines de condensation des NRPS, ce qui fait progresser notre compréhension de l'enzymologie des NRPS.

Ces travaux ouvrent de nombreuses perspectives. À court terme, la biosynthèse de l'azétidomonamide représente un excellent modèle pour étudier d'autres activités non-canoniques au sein des domaines NRPS. De plus, l'exploitation des connaissances biosynthétiques acquises, associée à l'exploration génomique, permettra d'accéder à de nouveaux AP et composés apparentés bactériens, notamment issus de pathogènes et de ceux d'importance écologique. À long terme, nous aborderons la question de la fonction biologique de ces composés chez les bactéries par une approche intégrative incluant des méthodes de biologie chimique, de –omiques, de microbiologie et de biochimie.

Bien que de nombreuses voies de biosynthèse chez les bactéries mènent à un ou à un nombre limité de produits, certains systèmes génèrent, à l’inverse, une diversité de métabolites. Les voies bactériennes responsables des alcaloïdes pyrrolizidines (AP) représentent des exemples notables de ce phénomène. Au sein de ces chemins, des synthétases peptidiques nonribosomiques (NRPS) bimodulaires et une monooxygénase, en combinaison avec des enzymes accessoires et/ou de la chimie spontanée, conduisent à divers azacycles, tels que les pyrrolizidines et les cyclocarbamates. Dans des travaux récents, il a été démontré que certains de ces composés atténuent la virulence de la souche productrice lors de l’interaction avec son hôte. Les mécanismes moléculaires qui régissent cette diversification, et ceux responsables de leur activité biologique, restent á déterminer. Etant donné le grand intérêt et potentiel pharmaceutique des molécules contenant un azacycle, ce projet propose de : déchiffrer la base moléculaire de la diversité chimique des pyrrolizidines bactériennes et les alcaloïdes apparentés ; d’établir des relations structure-fonction pour des enzymes clés de ces voies ; et d’appliquer les connaissances obtenues afin de générer de nouveaux dérivés dotés d’activités biologiques intéressantes, notamment comme composés « anti-virulence » efficaces contre un pathogène humain majeur, Pseudomonas aeruoginosa.