Rétablissement de l'équilibre excitation/inhibition pour moduler la dégénérescence des motoneurones dans la SLA – SynaptALS

Le groupe de Paris a réalisé tous les enregistrements électrophysiologiques intracellulaires in vivo de motoneurones identifiés à partir de noyaux moteurs spécifiques chez des souris adultes anesthésiées. Cette approche nous a permis d'étudier les propriétés électriques intrinsèques de chaque motoneurone, les circuits neuronaux simples du motoneurone (voie Ia monosynaptique, inhibition disynaptique de Renshaw…), d'injecter par iontophorèse dans le motoneurone enregistré (via la microélectrode intracellulaire) soit un agoniste de l'AMPc (AMPc-SP) soit un colorant (alexa, dextran) afin de marquer le motoneurone étudié pour un traitement histologique ultérieur. Après perfusion intracardiaque de PFA, des procédures histologiques ont été réalisées par le groupe de Paris afin de visualiser les motoneurones enregistrés et de détecter s'ils étaient infectés par le virus AAV9 muté (injections intramusculaires, trois semaines avant l'électrophysiologie). Le groupe de Paris a également réalisé un criblage approfondi des capacités infectieuses rétrogrades d'un large ensemble de virus AAV9 muté. L'imagerie a été réalisée à l'aide d'une microscopie confocale.

Le groupe Ulm a réalisé les techniques (qPCR, hybridation in situ quantitative) utilisées pour les études transcriptomiques des récepteurs couplés à Gs (PKA) et des canaux ioniques ; il a également utilisé une approche immunohistochimique pour étudier les marqueurs de la maladie. Le groupe Ulm a construit les virus utilisés dans le projet. En particulier, ils ont réalisé la la construction de GFE3 (domaines EGFP-FingR-E3). Ce système a été utilisé pour le contrôle des synapses inhibitrices : la protéine d'échafaudage synaptique gephyrine est ciblée pour la dégradation protéasomique par une ligase d'ubiquitine E3, qui est amenée à proximité de la gephyrine par une molécule de reconnaissance de type nanobody conjuguée à l'ubiquitine E3. Il a été prouvé que ce système dégrade efficacement les clusters de gephyrine et induit une perte du courant GABAR/GlyR. Le groupe Ulm a également utilisé l'imagerie à super résolution pour déterminer le contenu du récepteur glycinergique au niveau des synapses cellules Renshaw/motoneurones (identifié par immunomarquage à la calbindine).

Objectif 1

- Les récepteurs adrénergiques bêta2 et bêta3, couplés au Gs, sont peu ou pas dysrégulés chez les souris SOD1 présymptomatiques adultes (P45-P50) offrant des points d'entrée pour l'activation pharmacologique de la voie pKA (Ulm).

- L'administration aiguë d'agonistes bêta2/3 augmente la pente (gain) de la relation fréquence de décharge/intensité du courant (indiquant une excitabilité accrue) alors qu'elle n'a aucun effet sur la résistance d'entrée et le courant de recrutement (Paris). Elle régule à la hausse la transcription des gènes précoces immédiats, indiquant une activité neuronale accrue, et affecte la transcription des canaux ioniques qui règlent l'excitabilité (Ulm).

- L'injection intracellulaire d'un agoniste de l'AMPc dans des MNs augmente le gain démontrant que les agonistes bêta2/3 modulent l'excitabilité via la voie AMPc/PKA (Paris).

- L'administration prolongée (10 jours) d'agonistes bêta2/3 n'augmente plus le gain des MNs chez les souris WT et SOD1, indiquant une régulation homéostatique de l'excitabilité (Paris). Elle diminue l'expression des récepteurs bêta2/3 et n'a aucun effet sur les marqueurs de la maladie (Ulm).

- Au total, nos travaux démontrent que les MN sont soumis à une neuromodulation adrénergique via les récepteurs bêta2/3, neuromodulation soumise à un contrôle homéostatique.

- Ce contrôle homéostatique n'est pas dysrégulé chez les souris SOD1 présymptomatiques, ce qui contraste avec une hypothèse récente sur la physiopathologie de la SLA .

Objectif 2

- La conductance synaptique induite par l'inhibition Renshaw est similaire dans les MN des souris WT et SOD1 (électrophysiologie in vivo complexe, Paris).

- Légère altération des récepteurs glycinergiques sur SOD1 MN à P21 mais dans une moindre mesure à P45 (temps des expériences électrophysiologiques), mais il existe une régulation positive paradoxale des clusters GABAR (Ulm)

- Pas de changement dans la cinétique de l'inhibition de Renshaw suggérant que les changements dans les récepteurs glycinergiques et GABA se compensent mutuellement (Paris).

- Les clusters GlyR et GABAR sont tous deux sensibles aux changements d'excitabilité et aux changements de signalisation PKA; la dégradation de la géphyrine n'a pas de conséquence sur les synapses excitatrices alors que les marqueurs de la maladie sont significativement réduits (Ulm en collaboration avec Paris).

- Identification d'un nouvel AAV9 avec des mutations dans la capside qui infecte rétrogradement (depuis un muscle) le MN chez la souris adulte à un taux supérieur à 50 % (Paris et Ulm).

- Cela permet de réaliser des enregistrements électrophysiologiques intracellulaires in vivo dans les MN infectés par ces AAV9, ouvrant la voie à des études où l'expression des gènes est manipulée grâce à l'AAV9 muté (Paris).

Nos résultats indiquent qu'une activation pharmacologique prolongée des récepteurs couplés aux protéines Gs n'est peut-être pas la meilleure façon de provoquer une activation soutenue de la voie PKA. D'autres stratégies pharmacologiques, agissant plus directement sur la voie, devraient être envisagées (par exemple des médicaments agissant sur l'accumulation/dégradation de l'AMPc pourraient être testés).

Notre découverte d'un vecteur AAV9 muté doté d'une bonne capacité infectieuse rétrograde ouvre la voie à des expérimentations où la transcription de nombreux récepteurs membranaires, canaux ioniques, protéines synaptiques peut être manipulée. Cela permettra d'étudier plus en détail les mécanismes par lesquels les entrées synaptiques et l'excitabilité des MN interfèrent avec la physiopathologie de la SLA et, espérons-le, offrira un outil potentiel pour la thérapie génique.

La Sclérose Latérale Amyotrophique est une maladie du motoneurone (MN), à l'issue toujours fatale, qui produit une dégénérescence progressive des neurones corticospinaux ("upper MN") et des motoneurones bulbaires et spinaux ("lower MN") laquelle compromet les mouvements volontaires, la parole et la respiration. La survie moyenne après le diagnostique est estimée à 4-5 années. A ce jour, aucune approche, ni préventive, ni thérapeutique ne peut ralentir, ni encore moins stopper, la progression de la maladie. Plusieurs modèles génétiques murins ont révélé une vulnérabilité différentielle à la maladie des MNs à travers les noyaux moteurs, ou au sein même de chaque noyau moteur. Il a été récemment démontré, et les deux laboratoires impliqués dans ce projet ont largement contribué à cette démonstration, que l'excitation des MNs les plus vulnérables est réduite avant qu'ils ne dégénérent, et que le rétablissement de l'excitation réduit l'expression de marqueurs de la maladie. Ainsi, la perte de l'excitation des MNs apparait comme une étape critique de la dégénérescence des MNs dans la SLA. Quel est l'origine de ce phénotype? Est ce que cibler la perte d'excitation présente un intérêt thérapeutique? Des données préliminaires obtenues dans nos deux laboratoires montrent clairement que les entrées synaptiques des MNs sont anormales, très tôt dans la progression de la maladie, et que la dysfonction prend sa source dans un démantèlement des structures post-synaptiques. Dans ce projet, notre but est d'étudier si le disfonctionnement des synapses excitatrices peut être inversé par des manipulations chémogéntiques sélectives et de montrer que le rétablissement de l'équilibre excitation/inhibition rétablit la capacité de décharge des MNs, améliore les marqueurs de la maladie, et ralentit la neurodégénérescence. Celà représenterait une nouvelle stratégie thérapeutique avec des applications translationnelles. Cet objectif sera atteint grâce à des technologies complémentaires à la pointe du progrès que nos deux laboratoires maitrisent: vecteurs viraux (AAVs) avancés et manipulations chémogénétiques in vivo des entrées synaptiques et de l'excitabilité intrinsèque (équipe d'Ulm, Allemagne); exploration électrophysiologique in vivo des entrées synaptiques et des propriétés des MNs chez la souris (équipe parisienne, France). La démonstration que les perturbations synaptiques constituent un "primum movens" de la maladie serait un saut conceptuel très significatif, impliquant que la neurodégénérescence dépend fortement d'entrées synaptiques appropriées plutôt que de paramètres biochimiques, et qu'elle peut donc être ciblée thérapeutiquement au niveau des synapses.