Régulation de la réponse aux dommages de l’ADN par les clusters de phosphorylation du réseau de signalisation de p53 – DDRphosphoclus

Nous produisons plusieurs constructions comprenant diverses combinaisons de domaines des protéines que nous étudions ; nous les produisons de manière recombinante dans E coli pour permettre leur marquage isotopique abordable pour l'analyse RMN.
Nous suivons la cinétique de phosphorylation dans un fasgion spécifique de résidu en utilisant la spectroscopie RMN. Nous utilisons l'ITC pour mesurer les affinités entre les différents partenaires avant et après la phosphorylation.
Nous utilisons des approches CRISPR/Cas9 pour muter les gènes d'intérêt dans des cellules de mammifères, qui ont été préalablement modifiées pour exprimer p53, Mdm2 ou p21 portant des étiquettes fluorescentes. Nous surveillons la dynamique de p53 d'une manière spécifique à la cellule en utilisant la microscopie à cellules vivantes avant et après une lésion de l'ADN dans les lignées cellulaires générées.

Nous avons quantifié l'impact de tous les domaines repliés et désordonnés sur les affinités entre p53 et Md2m, avant et après phosphorylation ; nous avons également caractérisé cette interaction par RMN et montré que les interactions supplémentaires ne provoquent pas nécessairement des affinités plus élevées. Nous avons montré que les sites de phosphorylation de Mdm2 sont phosphorylés indépendamment.
Nous avons également montré que les sites de phosphorylation sont indépendants dans Chk2. Les 7 phosphosites de Chk2-N-terminal n'interfèrent pas avec la liaison de phosphoT68 au domaine central FHA de Chk2, responsable de sa dimérisation et de son auto-activation ; cependant ils ralentissent la mise en place de pT68. Nous observons également une accumulation plus rapide de p53 dans les lignées cellulaires mutantes de Chk2 (où les 7 phosphosites de Chk2 sont mutés).

Nous terminerons la caractérisation de la structure de Mdm2 avant et après la phosphorylation et mesurerons les affinités entre Mdm2 et p53 FL avant et après la phosphorylation.
Nous reproduirons le suivi en direct de la dynamique de p53 dans des lignées cellulaires plus stables que celles que nous avons établies.
Nous caractériserons également les domaines désordonnés de Wip1 et l'impact de sa phorphorylation sur sa structure et son activité.

- 3 Posters en conférences internationales, 1 en conférence nationale.
Publications:
1. The guardian's choice: how p53 enables context-specific decision-making in individual cells. Friedel, L., Loewer, A. FEBS Journal, 2022, 289(1), pp. 40–52
2. In-Cell Structural Biology by NMR: The Benefits of the Atomic Scale. Theillet, F.-X. Chem Rev, 2022, 122(10), pp. 9497–9570
3. In-cell NMR: Why and how? Theillet, F.-X., Luchinat, E. Progr. in Nucl. Magn. Reson. Spectr., 2022, 132-133, pp. 1–112
4. Generating Somatic Knockout Cell Lines with CRISPR-Cas9 Technology to Investigate SMAD Signaling. Huang, Z., Loewer, A. Methods Mol Biol, 2022, 2488, pp. 81–97

Le facteur de transcription p53 coordonne la réponse cellulaire aux dommage sde l'ADN. Le niveau protéique de la protéine p53et son activité sont contrôlés par un réseau de signalisation comprenant entre autres les kinases de réponses de dommages à l'ADN (DDR) ATM/ATR/DNAPK (PIKKs), la E3-ubiquitine ligase Mdm2, la phosphatase Wip1 et la kinase Chk2. L'activité des kinases/phosphatases et les boucles de rétrocontrôle génèrent des pulses d'accumulation de p53, dont la duré et le nombre détermine les réponses transcriptionnelles médiées par p53 et le destin cellulaire. La compréhension actuelle du système est la suivante: i) l'expression constitutive de p53 et la régulation de rétrocontrôle de sa E3-ubiquitine ligase Mdm2 maintiennent des niveaux protéiques basaux faibles; ii) les PIKKs activent p53 et inhibe Mdm2 tant que les dommages de l'ADN ne sont pas réparés; iii) l'accumulation de p53 déclenche l'expression de Mdm2 et Wip1; iv) Wip1 efface les modifications effectuées par les PIKKs. Bien que ces activités expliquent en grande partie les dynamiques observées de p53, de récents résultats, obtenus par des perturbations pharmacologiques ou des expériences de biochimie, ont mis en évidence l'existence de mécanismes de régulation supplémentaires.
Nos groupes se sont intéréssés à des mécanismes de phosphorylation du réseau de réponse aux dommages de l'ADN par p53 (p53-DDR) encore non-explorés: i) les protéines de ce réseau présentent des sites de (dé)phosphorylation par les PIKKs, Chk2 et Wip1 abondants et groupés; ii) les pulses répétés de p53 dépendent de l'activité de Chk2 plutôt que de celle des PIKKs. A partir de ces découvertes, nous formulons les hypothèses suivantes: i) les sites de modifications groupés agissent comme des tampons qui établissent des niveaux de seuil et des horloges moléculaires après les dommages de l'ADN; ii) ATM déclenche les pulses de p53 en réponse aux dommages sévères, tandis que Chk2 est responsable du maintien de l'activité de p53 et permet les réponses cellulaires aux dommages prolongés.
Nous proposons de valider ce modèle par des expériences combinées aux niveaux biochmique et cellulaire. Nous évaluerons comment la présence de phosphosites groupés modèle les cinétiques des DDR sévères et prolongées. A cette fin, nous nous concentrerons sur les modifications de Mdm2, Chk2 et Wip1 et comment elles affectent leurs activités. Concrètement: i) nous détaillerons les activités compétitives des PIKKs, Chk2 et Wip1 sur p53, Mdm2, Chk2 et Wip1 site par site et quantitativement grâce à la spectroscopie RMN; ii) nous mènerons des études structurales pour comprendre les mécanismes d'inhibition/déstabilisation de Mdm2, Chk2 et Wip1 par leurs phosphorylations; iii) nous examinerons les rôles fonctionnels des sites de phosphorylation par ingénierie génomique utilisant le système Cas9 et en observant des cellules uniques par microscopie de fluorescence de cellules vivantes; iv) nous évaluerons comment la balance entre les activité des PIKKS, Chk2 et Wip1 modèle la DDR dans les cellules. Ceci nous permettra de construire des modèles mathématiques rendant compte des niveaux de seuil de dommages de l'ADN et prédisant les dynamiques de long-terme de la p53-DDR. Ainsi, en intégrant des informations biochimiques et structurales, des données de signalisation cellulaire en temps réel et nue approche de biologie des systèmes, nous aurons accès à une meilleure compréhension de la réponse aux dommages de l'ADN par p53 et nous pourrons ainsi mieux la manipuler dans le contexte des thérapies anti-cancer.