Microscopie multimodale assistée par calcul Bayésien approximé pour explorer la mobilité nucléaire des facteurs de transcription – ABC4M

Comprendre la façon dont les facteurs de transcription explorent le noyau pour trouver leurs sites de liaison est une des principales étapes pour notre compréhension de l'expression génétique. Pour y parvenir, nous proposons de combiner des simulations informatiques et du calcul Bayésien approximatif (ABC) avec des méthodes simultanées de microscopie multimodales. Nous développerons une approche expérimentale basée sur l’application simultanée de la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) et de la microscopie de localisation en molécules uniques (sptPALM) pour cartographier la dynamique spatiotemporelle du facteur de transcription P-TEFb, le principal facteur dans la levée de la pause proximale pendant la transcription. Pour interpoler entre les échelles de temps et d'espace distinctes de chaque méthode de microscopie, nous utiliserons une approche de simulation par ordinateur basée sur le calcul bayésien approximatif (ABC) avec des simulations de Monte Carlo de la diffusion de P-TEFb dans des modèles réalistes du noyau. ABC4M fournira donc une image quantitative au niveau molécule unique de l'organisation spatio-temporelle de la dynamique qui a lieu dans le noyau pendant la levée de pause.
La levée de pause transcriptionnelle est un mécanisme qui contrôle l'allongement de la transcription. Une fois la transcription engagée, la moitié des molécules de polymérase II (Pol II) sont bloquées sur des sites de pause situés près du promoteur. Le facteur critique qui déclenche la libération de la pause Pol II est P-TEFb (pour Positive Transcription Elongation Factor b). En phosphorylant Pol II, P-TEFb la libère de l'état de pause et déclenche l’allongement productif de la transcription. L'activité du P-TEFb est elle-même modulée par plusieurs partenaires protéiques, dont la liaison module la capacité de léve de pause du P-TEFb. Les partenaires du projet ABC4M ont récemment contribué à une meilleure compréhension de la mobilité du P-TEFb dans les cellules vivantes par des approches de corrélation de fluorescence et/ou de molécule unique. ABC4M vise à réconcilier l'apparente disparité entre ces mesures à différentes échelles spatiales et temporelles par des approches expérimentales multimodales interpolées par des simulations numériques, et à apporter de nouvelles informations sur l'orchestration fondamentale de la levée de pause transcriptionnelle.
ABC4M déterminera ce qui impact majoritairement le mouvement de P-TEFb dans le noyau : encombrement macromoléculaire et sa distribution spatiale ? liaison à des sites d'ADN non spécifiques ? liaison à des partenaires protéiques ? autres mécanismes ? Nous allons cartographier la densité locale de la chromatine dans les noyaux de cellules vivantes à l'échelle nanométrique et la distribution spatiale des principaux partenaires de liaison du P-TEFb à l’aide de microscopie de localisation de molécule unique. Nous quantifierons la mobilité du P-TEFb dans le milieu complexe ainsi défini à deux échelles spatio-temporelles en utilisant une approche multimodale consistant en des mesures simultanées par sptPALM et par spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS). Nous utiliserons l'ABC basé sur les simulations de Monte-Carlo pour quantifier les données expérimentales aux échelles multiples du FCS et du SPT. De plus, la sélection de modèles basée sur l'ABC sera utilisée pour déterminer si l'organisation spatiale du milieu nucléaire et des partenaires de liaison du P-TEFb a effectivement un impact sur sa dynamique spatiotemporelle dans le noyau. Cela déterminera si les propriétés de la mobilité P-TEFb jouent un rôle fonctionnel dans l'orchestration de la libération de la pause transcriptionnelle.