Aspects fonctionnels et impact physiopathologique des inclusions lipidiques intracytoplasmiques chez les mycobactéries – ILIome

Une approche de « proximity labelling » couplée à la spectrométrie de masse sera utilisée pour biotinyler, enrichir, isoler et identifier les enzymes/protéines présentes à la surface de nos ILI.
Deux modèles expérimentaux robustes basés sur la formation et la dégradation des ILI pendant les processus de dormance et de réactivation, seront également utilisés pour décrypter le mode d'acquisition et de consommation des lipides par les mycobactéries.

Après avoir identifié les protéines naturellement biotynilées chez M. abscessus, nous avons mis au point, différentes expériences contrôles permettant de valider notre analyse par spectrométrie de masse des échantillons enrichis en streptavidine. Nous avons alors construit des plasmides codant pour APEX2 fusionné aux 3 différents gènes homologues : tgs1, Rv1683 et HBHA de M. abscessus.
Ces constructions ont été réalisées dans des plasmides permettant une production constitutive sous le contrôle du promoteur hsp60 (pMV261), inductible sous le contrôle du promoteur acétamide (pMyC) ou sous le contrôle de leur propre promoteur.
Après avoir vérifié la production de ses différentes protéines de fusion dans toutes les conditions de croissance, nous avons déterminé, par spectrométrie de masse, le protéome des ILI pendant leur formation à 24 et 48 h en utilisant le modèle d'ILI développé au laboratoire. A 24 h, 123 protéines ont été identifiées et à 48 h 143, dont 38 protéines qui étaient communes aux deux temps. Les analyses bioinformatiques ont permis de déterminer la fonction putative de chaque protéine et leur relation avec le métabolisme bactérien. Cette liste de gènes nous permet de commencer la construction des mutants de délétion afin d’étudier spécifiquement le rôle de chaque protéine. Nous avons décidé de nous concentrer sur toutes les protéines présentes à 24 et 48h dont la fonction est inconnue. Afin de confirmer dans des cellules vivantes si toutes les protéines identifiées sont colocalisées avec ILI, les gènes sélectionnés ont été fusionnés avec gfp. Toutes les constructions de plasmides recombinants sont disponibles et elles seront testées prochainement dans des bactéries vivantes pendant la formation des ILI. Si la co-localisation avec les ILI est confirmée, nous commencerons la construction des mutants de délétion dans M. abscessus. Pour conclure, l'interaction entre tous les partenaires est bonne et le programme devrait être respecté par tous.

Pour la suite du projet, nous générerons des échantillons pour étudier le protéome de la dégradation des ILI en utilisant le modèle in vitro et les analyses de spectrométrie de masse permettront de déterminer le protéome impliqué pendant ce processus. Les deux études permettront d’identifier les enzymes/protéines impliquées dans la formation et la dégradation des l'ILI.
En parallèle, nous prévoyons de reproduire les mêmes expériences dans des cellules infectées, où la bactérie utilise les lipides de l'hôte pour former son ILI. Et le but de cette étude permettra de comparer les protéines présentes les ILI dans des conditions in vitro et ex vivo.
Dans le même temps, le partenaire 2 terminera les mutants de délétion nécessaires pour étudier le rôle physiologique de chaque cible.
Pendant que le partenaire 3 fera les analyses protéomiques, le partenaire 1 commencera les expériences sur les BMDM des souris KO prévues à la tâche 1. Nous devrions avoir toutes les souris homozygotes à la fin de l'été.
Même si nous avons perdu du temps principalement en raison de problèmes administratifs, le programme de cette année devrait être respecté. De plus, durant la deuxième partie de ce projet, 2 ou 3 études devraient être prêtes à être publiées.

1. Intrabacterial lipid inclusions in mycobacteria: unexpected key players in survival and pathogenesis?. Mallick I, Santucci P, Poncin I, Point V, Kremer L, Cavalier JF, Canaan S. FEMS Microbiol Rev. 2021 May 24:fuab029. doi: 10.1093/femsre/fuab029.
2. Intrabacterial Lipid Inclusions: overview of an amazing organelle. Tonia Dargham, Ivy Mallick, Dominique Raze, Laurent Kremer and Stéphane Canaan, Elsevier.com/books and Journal, doi.org/10.1016/B978-0-323-91948-7.00003-8 253

M. tuberculosis, l'agent de la tuberculose (TB) est capable de stocker des triglycérides (TAG) sous la forme d’Inclusions Lipidiques Intracytoplasmiques (ILI) au sein des macrophages spumeux et dans les centres caséeux du granulome. Gorgés de lipides, ces bacilles peuvent persister silencieusement, conduisant à l’établissement d’une TB latente. Lors de la réactivation tuberculeuse, l’hydrolyse des TAG contenus dans ces ILI facilite la croissance et la propagation du bacille. Ce phénomène d’accumulation et de dégradation des lipides intracellulaires est également observé chez la plupart des mycobactéries. Ainsi, le projet ILIome va consister à étudier les aspects fonctionnels et l’impact physiopathologique de ces inclusions lipidiques intracytoplasmiques chez les mycobactéries. Pour cela nous avons prévu 1) de déterminer pour la première fois la contribution d’enzymes de l’hôte dans la formation et la dégradation des ILI ; 2) d’identifier et de caractériser les protéines mycobactériennes physiquement associées aux ILI et impliquées soit dans leur formation et soit dans leur dégradation ; 3) d’étudier au moyen de mutant de délétions le rôle des protéines identifiées dans la physiopathologie mycobactérienne en utilisant divers modèles cellulaires et animaux. Ce projet original de par les techniques utilisées mais aussi par son importance apportera des informations inédites sur le cycle de vie des mycobactéries pathogènes, inspirant probablement des stratégies thérapeutiques innovantes de lutte contre la TB.