Intégration du fastFLIM et du partening de champs évanescents pour l'optogénétique – OFFER

L'excitation TIRF conventionnelle est par essence un éclairage à large champ et ne permet pas le confinement latéral de l'excitation lumineuse dans les régions d'intérêt (ROI) subcellulaires. Sur la base de notre nouveau concept EFP, nous avons développer de nouvelles méthodes et les métriques d'évaluation associées pour l'acitvation dynamique et localisée de région d'intérêt (ROI) sous excitation TIRF.

L'intégration de l'imagerie Fast-FLIM en mode TIRF était plus cadré du fait de l'expérience du partneaire 2 et de la société Inscoper. Le point le plus difficile a été de screener parmi de nombreuses possibilités une source Laser pulsées suffisament stable et puissante pour obtenir un effet TIRF compatible avec la méthode Fast_FLIM. Cela a été possible grâce à une source et le contrôleur Taiko prêté puis acheté chez optonLaser.

La thèse de M. Grosjean s'est focalisé à développer de nouvelles méthodes et métriques pour améliorer les performances de l'EFP. Les succès rencontrés ont permis de développer deux méthodes fiables pour faire des pattern d'excitation TIRF par point et par pattern encodé. Cela a conduit au dépôt d'un brevet et d'un article (Grosjean Opt Express. 2024 May 20;32(11):19480-19494.)

Le système Fast-FLIM a été développé par le partenaire 2 et intégré dans l'équipe du partenaire 1 avant d'être rendu accessible à l'ensemble des utilisateurs de la plateforme IAB-MicroCell.

Nous continuons à explorer les possibilités et limites de cette approche d'imagerie très originale et qui attire des collaborations locales et étrangères. Malheureusement, le module EFP n'a pas encore pu être complètement intégré.

Nous allons continuer l'utiisation de l'imagerie FastFLIm-TIRF dans de très nombreux projets et intégrer le module EFP pour réaliser de nouveaux types d'expérience d'optogénétique contrôlées spatialement. Nous avons aussi comme projet de développer de nouvelles façons de faire de l'imagerie métabolique extracellulaire hautement challengeantes.

Ce projet nous a permis d'obtenir deux autres financements (Plan Cancer Inserm 2024 et Equipement-UGA 2024) et nous avons ainsi stabilisé ce microscope aux performances uniques et peu accessibles en laboratoires académiques ou sur plateformes d'imagerie.

L'imagerie live et les biosenseurs permettent de quantifier les activités biologiques subcellulairement. L'optogénétique complète ces méthodologies descriptives en permettant des approches perturbatives à l’imagerie live. L’optogenetique utilise des éléments photosensibles naturels pour contrôler une activité biologique. La haute sensibilité des éléments photosensibles naturels permet d'activer la plupart des sondes optogénétiques avec la majorité des sources de lumière commerciales. Cependant, l'activation optogénétique présente des limitations spatio-temporelles et spectrales. Nous proposons de construire le premier microscope dédiée pour surmonter les limitations optogénétiques au niveau subcellulaire. Nous intégrerons deux nouvelles technologies brevetées sur un microscope TIRF afin d'améliorer la résolution spatiale des activations optogénétiques à l'échelle subcellulaire et pouvoir les combiner facilement avec une imagerie multispectrale.