CE42 - Capteurs, instrumentation

Microscopie super résolue polarisée pour l'imagerie conformationnelle – 3DPolariSR

Imagerie super résolution polarisée pour l’imagerie des changements de conformation de proteines en cellules vivantes

Développement d’un module de microscopie et de marquages fluorescents associés pour la détection de changements conformationnels de protéines impliqués dans l’adhésion cellulaire par microscopie de localisation et orientation de molécules uniques (SMOLM).

Développement d’un prototype de microscopie et de marquages appropriés pour l’imagerie polarisée de localisation et orientation de molécules uniques

Le projet 3DPolariSR vise à imager les modifications orientationnelles de protéines en imagerie de fluorescence super-résolution polarisée. Le consortium vise la fabrication d’un prototype sous la forme d’un module adaptable à la microscopie optique, transférée à terme au partenaire industriel. Une étude de faisabilité sera menée à partir du savoir-faire développé par le coordinateur (partenaire P1) sur l’utilisation de la polarisation de la lumière en microscopie, pour mesurer d’une manière non ambiguë la localisation spatiale 3D, l’orientation moyenne 3D et l’étendue des fluctuations angulaires d’un émetteur fluorescent. L’évaluation de l’efficacité des estimateurs sera effectuée pour deux stratégies optiques possibles (WP1). Cet outil sera accompagné de la mise en place d’un algorithme robuste pour l’imagerie orientationnelle et spatiale haute précision de molécules uniques (WP2). Ce développement permettra de valider les outils moléculaires développés conjointement par les partenaires chimiste (P3) et biologiste (P4), pour aboutir à des marquages génériques de protéines pour lesquels le fluorophore est lié le plus rigidement possible à la protéine d’intérêt (WP3). Enfin ces outils de microscopie et moléculaires seront appliqués par le partenaire P4 pour l’étude du comportement orientationel des protéines des sites d’adhésion cellulaires, dont l’organisation est encore mal connue (WP4).

Les méthodes implémentées dans ce projet sont
- Des modules de détection de localisation/orientation de molécules uniques, par (i) détection polarisée par split d’image (4polarisation) et (ii) détection par PSF engineering
- Des softwares d’analyse d’image associés à ces modules
- Des constructions biologiques de protéines fluorescentes et tags attachés aux protéines d’intérêt des sites d’adhésion cellulaire
- Des analyses de données orientationnelles et de localisation sur les protéines des sites d’adhésion cellulaire, dans des conditions de stimulation de l’activité d’adhésion

- WP1 (instrumentation P1-P2) : le dispositif « image splitting » (4polar) a été validé dans sa version ‘home made’ (P1), et utilisé pour quantifier le degré d’orientation et l’orientation 3D de fluorophores. Une étude sur des origamis greffés de fluorophores type cyanines a permis de valider l’approche d’attachement de fluorophores pouvant servir d’orientations de références pour la technique (collaboration ETH-Zurich, une publication soumise). Une version abbelight (P2) du module à adapter pour le 4polar a été transférée à Marseille (P1). Les tests ont montré la nécessité d’adapter les optiques et optomécaniques, notamment par le remplacement des miroirs par des coatings moins perturbateurs pour la polarisation (Ag protégé au lieu de diélectrique) (travail en cours). Le dispositif « PSF engineering » (BFP filtering) a été upgradé pour être utilisé en multi-longueur d’onde, sa validation est en cours (P1).
- WP2 (software P1-P2) : Une version d’algorithme de traitement des images 4polar est actuellement en cours d’amélioration (l’analyse d’image fonctionne actuellement par une estimation des intensités qui peut être davantage optimisée pour s’adapter à la forme des PSF et accéder à la position axiale des molécules, en plus de son orientation et position latérale) (P1,P2). Deux approches sont en cours d’étude : deep learning (P2) et PSF fitting (P1).
- WP3 (biomolecular probes P1-P3) : Différentes stratégies sont en cours d’évaluation pour créer un lien rigide entre un rapporteur fluorescent protéique et une protéine d’intérêt. Différents rapporteurs fluorescents (HaloTag, FAST) et différentes stratégies de rigidification (utilisation de permutation circulaire, création de linkers rigides hélicoïdaux) sont en cours de validation. Nous avons effectué un crible de troncature de mEos3.2 (largement utilisé pour sptPALM (P3)), qui a montré que nous pouvons enlever jusqu'à 4 résidus coté N-terminal et 9 résidus coté C-terminal sans perdre la fluorescence, tout en gardant la capacité photoconvertible.
- WP4 (biology P1-P4) : la nouvelle construction décrite plus haut, basée sur mEos3.2, a été testée par sptPALM dans des cellules vivantes à Bordeaux (P4) et s'est avérée fonctionnelle grâce à trois tests : (i) localisation aux adhésions focales, (ii) activation par le manganèse et (iii) comportement diffusif mesuré par sptPALM. Par ailleurs, des expériences effectuées par P4 sur le module abbelight (P2) présent dans ses locaux à Bordeaux ont permis de valider la capacité de l’imagerie de localisation 3D par SAF (imagerie par filtrage des angles super critique) dans les sites d’adhésion. Ce module sera ensuite modifié pour y ajouter la fonctionnalité d’une projection en 4 polarisation (test actuels chez P1).

- WP1 : dans la prochaine période du projet, les partenaires vont finaliser le développement du prototype de l’imagerie 4polarisation (image splitter) et poursuivre le développement de l’imagerie par PSF engineering. Le prototype 4polarisation sera utilisé pour les premiers tests sur les constructions contraintes orientationnelles seront testées
- WP2 : les codes d’analyse des images par deep learning et PSF fitting seront finalisés et implémentés dans une plateforme de software associée au module de détection polarisée.
- WP3 : les constructions basées sur les protéines photoactivables et tags seront fabriquées et testées pour leur caractère de brillance et de contrainte orientationnelle.
- WP4 : les premières mesures de sptPALM orientationnel seront effectués sur les protéines actin, taline et intégrine dans les sites d’adhésion cellulaire.

1. Carla Silva Martins et al. Human septins in cells organize as octamer-based filaments mediating actin-membrane anchoring (Submitted to J Cell Bio 2022) – bioRxiv doi: doi.org/10.1101/2022.02.23.481653
2. C. Rimoli, C. Valades Cruz, V. Curcio, M. Mavrakis, S. Brasselet. 4polar-STORM polarized super-resolution imaging of actin filament organization in cells. (bioRxiv 2021.03.17.435879 (2021)) Nat. Communications 13, 301 (2022). DOI: 10.1038/s41467-022-27966-w

Suivre les modifications conformationelles de protéines et la manière dont elles s’assemblent à l’échelle nanométrique, sont des éléments essentiels en biologie et pour les sciences du biomédical. Cela représente un réel défi, qui nécessite de savoir non seulement où les protéines sont localisées, mais également comment elles sont orientées. 3DPolariSR se propose de relever ce défi en dépassant l’état de l’art de la microscopie super-résolue par localisation de molécules uniques en détection polarisée. Le consortium combinera ses expertises en optique, instrumentation, théorie du signal, traitement des données, ingénierie des protéines et biologie, pour aboutir à une solution pour le marché de la microscopie optique, transférée à terme au partenaire industriel. Une étude de faisabilité sera menée à partir du savoir-faire développé par le coordinateur (partenaire P1) sur l’utilisation de la polarisation de la lumière en microscopie, pour mesurer d’une manière non ambiguë la localisation spatiale 3D, l’orientation moyenne 3D et l’étendue des fluctuations angulaires d’un émetteur fluorescent. L’évaluation de l’efficacité des estimateurs pour plusieurs stratégies optiques possibles (séparation des signaux polarisés dans le plan image, manipulation par lame de phase dans le plan de Fourier) permettra de déterminer le montage optique optimal à transposer sous forme de prototype par le partenaire industriel P2 (WP1). Cet outil sera accompagné de la mise en place d’un algorithme robuste pour l’imagerie orientationnelle et spatiale haute précision de molécules uniques (WP2). Le dispositif final technique et logiciel bénéficiera de l’expérience de P2 en commercialisation de systèmes modulaires pour l’imagerie super-résolue. Ce développement permettra de valider les outils moléculaires développés conjointement par les partenaires chimiste (P3) et biologiste (P4), pour aboutir à des marquages génériques de protéines pour lesquels le fluorophore est lié le plus rigidement possible à la protéine d’intérêt (WP3). Enfin ces outils de microscopie et moléculaires seront appliqués par le partenaire P4 pour l’étude du comportement orientationel des protéines des sites d’adhésion cellulaires, dont l’organisation est encore mal connue (WP4). Ce nouvel outil permettra d’établir le rôle des modifications dynamiques conformationelles spatio-temporelles des protéines impliquées dans la mécanotransduction cellulaire. Ce projet aboutira, à plus large échelle, à une solution technologique nouvelle pour l’imagerie super-résolue des conformations et organisation des protéines dans les cellules et les tissus.

Coordination du projet

Sophie BRASSELET (Centre National de la Recherche Scientifique Délégation Provence et Corse_Institut Fresnel)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

IINS INSTITUT INTERDISCIPLINAIRE DE NEUROSCIENCES
CNRS DR12_UMR7249 Centre National de la Recherche Scientifique Délégation Provence et Corse_Institut Fresnel
Abbelight AbbeLight / Direction R&D
LBM Laboratoire des biomolécules

Aide de l'ANR 637 076 euros
Début et durée du projet scientifique : janvier 2021 - 48 Mois

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