Dynamique du microbiome d'un organisme sentinelle aquatique en fonction de contaminants – Dyn-Microbiome

Afin d’étudier le rôle du microbiote dans un contexte écotoxicologique, ce projet propose le développement d’une approche métaprotéomique innovante, encore très peu utilisé dans ce domaine. L’atout majeur de cette approche est sa capacité d’apporter des informations en un seul cycle d’analyse relativement court concernant (i) la composition taxonomique du microbiote, (ii) ses fonctions métaboliques bénéfiques pour l’hôte, ainsi que (iii) des biomarqueurs de l’état de santé de l’organisme hôte. Les analyses sont réalisées à partir d’intestins de gammares issus d’expérimentations en laboratoire ou in situ. Un protocole d’extraction et de protéolyse des protéines sur gel a été mis en place. Les digestats obtenus représentent un mélange de peptides qui sont par la suite analysés par spectrométrie de masse haute résolution en tandem couplée à de la chromatographie liquide (LC-MS/MS). Les données LC-MS/MS sont ensuite traitées par un ensemble d’outils bioinformatiques, nommé pipeline métaprotéomique, développé au sein de l’équipe du Li2D. Ce pipeline repose sur l’interrogation de bases de données généralistes et d’une base de données dérivée du séquençage de l'ARN de l'hôte. Des requêtes contre ces bases de données sont réalisées en plusieurs étapes en cascade afin d’augmenter le taux d’assignement des spectres MS/MS à des peptides, spécifiques de taxons ou non, et ainsi déterminer la composition du microbiote. Ce pipeline permet également l’annotation fonctionnelle des protéines du microbiote ou de l’hôte, et les associe à des processus moléculaires et cellulaires ou des voies métaboliques dans lesquelles elles sont impliquées. De cette manière, ces informations favorisent la compréhension de la fonction du microbiote, ainsi que de l’état physiologique de l’hôte.

La première phase du projet a consisté au développement d’un pipeline de métaprotéomique comparative. Une première campagne d’analyse a permis d’étudier les effets du fongicide tébuconazole, détecté dans les milieux aquatiques, sur la composition taxonomique du microbiote et de ses fonctions, ainsi que sur l’état de santé de l’organisme hôte. Pour cela, des gammares mâles ont été soumis à trois expositions en conditions contrôlées de laboratoire : 0, 50 et 200 µg/L. Après 15 jours d’exposition, les individus (n=15 par condition) ont été mis à jeun pendant 24h, période durant laquelle les fèces ont été récoltés. Les organismes ont été ensuite sacrifiés et les intestins (vides) disséqués pour analyse. Les données métaprotéomiques générées concernent dans un premier temps les échantillons d’intestins. Ainsi, le pipeline a pu confirmer l’identification taxonomique de 16 genres (4 eucaryotes, 10 bactéries, et 1 archée) regroupés sous 9 phyla : Arthropoda, Chordata et Streptophyta pour les eukaryotes, Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes et Proteobacteria pour les bactéries, et Candidatus Thorarchaeota pour les archées. Comme attendu, la majorité des peptides spécifiques concerne l’organisme hôte appartenant au phylum Arthropoda. En revanche les peptides détectés spécifiques au microbiote sont en faible quantité. Au niveau de la structure taxonomique du microbiote, les analyses statistiques différentielles n’ont pas mis en évidence de différence notable chez les individus exposés par rapport à la condition témoin. D’un point de vu fonctionnel, le tébuconazole affecte certains processus du microbiote relatifs à la motilité cellulaire (dès 50 µg/L) et des processus de transport et de catabolisme, métabolisme des terpenoïdes et polykétides, et de résistance aux médicaments (200 µg/L).

Au regard de ces premiers résultats, la faible quantité de peptides spécifique au microbiote ainsi que l’absence d’effet marqué du tébuconazole observé sur la structure taxonomique du microbiote pourrait être du au type d’échantillon analysé. Les intestins étant préalablement vidés pour récolter les fèces, ils ne possèderaient pas suffisamment d’information concernant le microbiote. Il serait donc intéressant de réaliser ces analyses sur les échantillons d’intestins pleins ou de fèces afin d’augmenter le signal du microbiote et potentiellement d’observer des effets du tébuconazole sur la structure du microbiote. Si le choix des fèces s’avère plus pertinent, cela permettrait d’aller vers des méthodes d’échantillonnage non-invasive, évitant le sacrifice des animaux.

Quatre premières publications issues de ces travaux portent sur l’utilisation de la métaprotéomique en diagnostic environnemental et l'amélioration de la méthodologie métaprotéomique:
DOI: 10.1002/pmic.202200055
DOI: 10.1128/msystems.00589-22
DOI: 10.1111/1462-2920.16238
DOI: 10.1186/s40168-024-01766-4

Le microbiote est un facteur clé pour la santé d’un animal et sa sensibilité aux contaminants. Le projet "Dyn-Microbiome" décryptera la nature et le rôle du microbiote de l'hôte dans la modulation de la toxicité des contaminants pour un animal sentinelle aquatique, l'amphipode Gammarus fossarum, largement utilisé en biomonitoring en France. Nous avons développé une approche innovante en métaprotéomique qui renvoie la composition taxonomique du microbiote, quantifie les biomasses respectives, décrypte leurs principales voies métaboliques et des marqueurs moléculaires de l’hôte. Cette technologie, associée à des données de métagénomiques, permettra i) d’établir si des modifications des paramètres du microbiote sont induits par des toxiques modèles (métaux, hydrocarbures aromatiques polycycliques, antifongiques et antibiotiques), ii) d’évaluer les conséquences néfastes de dysbioses à long-terme pour l'hôte, et iii) de proposer de nouveaux marqueurs moléculaires d’exposition.