Contrôle du transport de K+ dans la baie de raisin par l'acide abscissique – KABAGRAPE

Plusieurs approches sont proposées, à la fois pour identifier des régulateurs des systèmes de transport par interactions protéine-protéine et pour comprendre le rôle de ces régulateurs.
L'identification de protéines candidates s'effectue par des criblages d'interaction protéine-protéine en levure (double hybride et split-ubiquitine). Aucune banque d'ADNc n'ayant été produite dans cet objectif pour la baie de raisin, nous proposons de créer des banques de double-hybride et split-ubiquitine dans le cadre du projet.
La vigne se prêtant difficilement à des analyses génétiques, la validation génétique sera effectuée dans l'espèce modèle Arabidopsis thaliana, et plus spécifiquement dans les graines en germination qui sont particulièrement bien étudiées pour la signalisation de l'ABA. Des mutants pour les gènes homologues/orthologues codant les canaux/transporteurs et leurs régulateurs sont analysés. Les phénotypes recherchés concernent la dormance de la graine, la balance ABA/acide gibbérellique, la résistance à l'ABA, la croissance sur milieu pauvre en K+... Les interactions épistatiques seront analysées par l'associations de mutations et par la création de lignées surexprimant les gènes d'intérêt.
Les études d'expression des gènes seront effectuées par Q-PCR et hybridation in situ. Les mesures de Q-PCR seront corrélées à des quantifications de l'ABA et de ses métabolites dans les mêmes tissus.
Pour les études fonctionnelles, destinées à estimer l'impact de la protéine régulatrice sur l'activité du canal cible, la co-expression dans l'ovocyte de xénope, suivie d'une mesure des courants par la méthode de voltage-clamp à deux électrodes, est la technique privilégiée. Les analyses in planta vont être effectuées dans l'épiderme de tabac (co-expression de protéines avec un «tag« fluorescent pour visualiser leur co-localisation et l'effet de la présence de la protéine régulatrice sur la localisation subcellulaire du canal ou transporteur) et des protoplastes de baie de raisin transformés (patch-clamp).

- Pour le workpackage 1 (partenaire 1), nous avons mis en évidence des réseaux de régulation partant de l'ABA pour arriver jusqu'aux effecteurs terminaux que constituent les canaux potassiques. Ces réseaux impliquent des récepteurs à l'ABA (PYR/PYL/RCAR), des protéine phosphatases 2C impliquées dans la signalisation de l'ABA, ainsi que des kinases non encore répertoriées en tant que régulateurs des canaux. Pour identifier de nouveaux régulateurs, nous avons produit des ARN de baies en quantité suffisante pour préparer des banques d'ADNc, et commencé la création d'une banque pour des criblages en double hybride.
- Pour le workpackage 2, de nombreux mutants ont été génotypés pour des insertions d'ADN-T dans les gènes codant les systèmes de transport de K+ d'Arabidopsis. Les résultats des premiers phénotypages montrent que certaines lignées ont des phénotypes qui peuvent être marqués concernant la germination ou les réponses hormonales.

Les perspectives les plus immédiates vont être dans la continuation de ce qui a été démarré: finalisation de la création de banques d'ADNc pour les interactions protéine-protéine, criblage de ces banques, et recherche/confirmation de phénotypes pour les mutants d'Arabidopsis. De nouvelles lignées mutantes ou surexprimant les gènes codant les protéines régulatrices vont être créées.
Dès que les résultats des criblages pour les interactions seront disponibles, les lignées mutantes correspondant aux gènes d'intérêt seront recherchées et phénotypées, et l'effet des protéines candidates sur l'activité des canaux sera mesuré par électrophysiologie dans l'ovocyte de xénope.
Les perspectives plus lointaines sont décrites dans les parties «Enjeux et objectifs« et «Méthodes«.

Pas encore de publication pour ce projet.

KABAGRAPE a pour objectif d’identifier les réseaux de gènes dépendants de la voie de signalisation de l’acide abscissique (ABA) impliqués dans l’augmentation du chargement en potassium (K+) observée en réponse aux fortes températures durant la maturation du raisin. En effet, l’entrée en maturation de la baie (appelée véraison) est déclenchée par l'ABA, et cette hormone bien connue pour son rôle dans la réponse au stress hydrique est aussi impliquée dans l’adaptation de la vigne aux températures élevées. Or en cette période de changement climatique, il est connu que l’exposition du raisin aux fortes températures est le facteur externe qui affecte le plus la qualité de la baie à la vendange, conduisant à l’obtention de vins de faible qualité organoleptique avec un potentiel de vieillissement amoindri. En particulier, l’augmentation de température favorise l’accumulation de K+ qui, s’il se trouve en excès dans la baie, a des effets néfastes sur la qualité du vin.
L’ABA a été identifié comme un acteur essentiel de la maturation du raisin. Dans la baie de raisin, la concentration de l’ABA augmente au moment de la véraison, puis au cours de la maturation en cas de forte chaleur. Chez Arabidopsis, il est établi que l’ABA contrôle l’activité des systèmes de transport de K+ (canaux Shaker et transporteurs KUP) et donc le chargement de K+ dans les différents tissus. Cette activité est régulée par des protéines phosphatases 2C (PP2C) du clade A et des kinases impliquées dans la signalisation de l’ABA, telles que les « Calcineurin B-like Interacting Protéine Kinases » (CIPK), et les « SNF1-related kinases » (SnRK2), et ce via des interactions protéine-protéine directes.
Dans la baie de raisin, nous voulons comprendre comment l’ABA régule l’entrée (via le phloème) et l’accumulation de K+ à travers son action sur les systèmes de transport. En plus des CIPK déjà publiées, nous avons identifié récemment des PP2C en interaction avec les canaux Shaker, et des protéines appartenant à des familles encore non associées au transport de K+ chez les plantes : une kinase de type « receptor-like » (RLK), qui interagit avec une PP2C de la voie de signalisation de l’ABA, et un transporteur ABC proche des transporteurs d’ABA d’Arabidopsis. Dans KABAGRAPE, nous analyserons ces nouveaux régulateurs et leurs homologues proches et rechercherons d’autres candidats.
Le projet est divisé en quatre « workpackages » (WP 1 à 4). Le WP1 aura pour but d'identifier les protéines régulatrices en interaction avec les systèmes de transport de K+ de la baie, à la fois par tests d'interaction systématiques et par criblages de banques d'ADNc en double hybride et split-ubiquitine. Nous avons sélectionné comme cibles primaires les canaux Shaker les plus exprimés dans la baie, ainsi qu'un transporteur KUP fortement induit à partir de la véraison. Pour valider la dépendance à l'ABA des protéines candidates et leurs relations avec les systèmes de transport, nous utiliserons dans le WP2 une stratégie originale de phénotypage au stade germination de mutants d'Arabidopsis déficients pour les orthologues des gènes d'intérêt (codant les systèmes de transport de K+ et leurs régulateurs), de lignées surexprimant ces gènes, et de combinaisons de génotypes. Dans le WP3, nous caractériserons l’expression spatio-temporelle des gènes d’intérêt dans la baie de raisin et leur réponse aux stress, en relation avec l’accumulation de l'ABA et de ses dérivés. Enfin, le WP4 visera à comprendre le rôle fonctionnel des protéines régulatrices sur les systèmes de transport de K+ : effets sur leur localisation subcellulaire et sur le transport de K+ (par électrophysiologie en ovocyte de xénope et sur des protoplastes de baies, et/ou complémentation de levure). Notre consortium associe 2 groupes aux compétences complémentaires : (1) (électro)physiologie et biologie moléculaire du transport de K+ chez Arabidopsis et la vigne, (2) physiologie de la germination de la graine et des régulations hormonales.