Potentialisation de la thrombolyse post-AVC par des nanovecteurs d'oxyde de cérium – STRIC-ON

La synthèse des nanoparticules destinées à améliorer la dégradation du caillot et à limiter le stress oxydant a reposé sur les étapes suivantes :

- les nanoparticules d'oxydes de cérium(CNP) ont été dans une première étape recouvertes de polymères de polyéthylèneglycol (PEG) qui permettent 1) d'éviter qu'elles s'agrègent entre elles et 2) de greffer la DNase I sur la fonction amine des PEG. Les caractéristiques de ces nanoparticules recouvertes par les PEG (CNP@PEG) sont ensuite étudiées (taille, forme, homogénéité, quantité de polymères entourant chaque nanoparticule et nombre d'amines qu'elle porte).

- la deuxième étape a consisté à tester deux techniques pour greffer la DNase I, l'une consistant à la greffer directement sur la fonction amine des PEG, l'autre à utiliser un agent, le glutaraldéhyde, pour faire le lien entre l'amine des PEG et la DNase I.

Une fois les nanoparticules complètes (CNP@PEG-DNase) produites, il a été vérifié que le recouvrement par les PEG et le greffage de la DNase I n'avaient altéré ni l'activité antioxydante des nanoparticules, ni la capacité de la DNase I à cliver l'ADN :

- pour les capacités antioxydantes, ceci a été réalisé directement sur des radicaux libres oxygénés ou sur des cultures de cellules endothéliales de souris; ces cellules endothéliales font partie de la paroi des vaisseaux sanguins et peuvent donc être endommagées par les radicaux libres oxygénés produits lors de la reperfusion post-AVC. Les cellules en culture ont donc été soumises à un stress oxydant induit par le glutamate, un médiateur libéré massivement pendant l'AVC, et l'effet des CNP@PEG-DNase étudié. Nous avons également étudié la toxicité de nos CNP sur ces cellules endothéliales. Les CNPs ont également pu être greffées avec des agents fluorescents pour observer leur internalisation dans les cellules endothéliales.

- pour vérifier que la DNase I greffée sur les CNP conservait sa capacité à cliver l'ADN, nous avons testé son activité sur de l'ADN fibrillaire et sur des NETs obtenus par stimulation de neutrophiles isolés du sang par le phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA).

Enfin, nous avons étudié les effets de nos nanoparticules couplées avec la DNase I sur la dégradation du caillot induite par le r-tPA :

- la première étude a été réalisé sur un caillot sanguin formé dans un puits sous la forme d'un anneau (test du halo). La dégradation de ce caillot par les traitements entraîne l'apparition d'une coloration rouge au centre dont l'intensité peut être mesurée,

- la deuxième étude a consisté à travailler sur des caillots enrichis en neutrohiles stimulés par pour produire des NETs et à mesurer la perte de poids du caillots en présence des traitements; le pourcentage de perte de poids est un indicateur de la dégradation du caillot.

- la troisième technique a consisté à faire passer un flux sanguin dans des microcanaux et à filmer la formation d'un caillot et sa dégradation par le r-tPA associé à la DNase seule ou greffée sur les CNPs.

Les CNP nues s'agrègent à pH physiologique (7,4) ce qui les rend impropres à une administration chez l'homme ; les polymères utilisés pour recouvrir les CNP (PEG) ont permis d'éviter leur agrégation (Figure 1 A-C). La taille de ces CNP-PEG est entre 10 et 25 nm (selon le PEG utilisé) et très homogène (Figure 1 D-F).

L'utilisation de glutaraldéhyde pour faire le lien entre la fonction amine des PEG et la DNase I a permis un greffage plus important de l'enzyme; cette technique a donc été conservée.

Les nanoparticules CNP@PEG-DNase conservent leurs propriétés anti-oxydantes : elles ont en effet été capables de dégrader les anions superoxydes par leur activité superoxyde dismutase et le H2O2 par leur activité catalase (Figure 2). L'activité antioxydante a également été étudiée sur des cultures de cellules endothéliales. Des études préliminaires ont tout d'abord montré que les CNP@PEG-DNase pénétraient dans les cellules (Figure 3) sans induire de mortalité (Figure 4). Les cellules endothéliales ont ensuite été traitées par le glutamate qui a induit une production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS); celle-ci a pu être réduite par un antioxydant de référence, la N-acétylcystéine (NAC) (Figure 5). Comme la NAC, les CNP@PEG-DNase ont totalement supprimé la production de ROS induite par le glutamate montrant ainsi qu'elles ont conservé leur capacité antioxydante malgré le recouvrement par les PEG et le greffage de la DNase I.

La DNase I greffée sur les CNP-PEG a de son côté conservé sa capacité à dégrader l'ADN avec une activité semblable à la DNase I non greffée. Ceci a pu être montré sur de l'ADN fibrillaire (ADN seul) (Figure 6) ou sur l'ADN de NETs produits en stimulant des neutrophiles.

Les expérience suivantes ont consisté à étudier la capacité des nanoparticules à améliorer la dégradation du caillot induite par le rt-PA. Dans le test du Halo, l'association des CNP@PEG-DNase au rt-PA permet une lyse plus importante du caillot que le rt-PA seul. Un résultat identique a été obtenu sur des caillots de sang enrichis en NETs . Les CNP@PEG-DNase associées au r-tPA ont également amélioré la dégradation du caillot dans un système de canaux permettant de reproduire un flux sanguin.

La capacité des CNP@PEG-DNase à améliorer la dégradation par le r-tPA de caillots formés à partir de sang humain est très prometteuse. La suite de ces travaux va consister à étudier les effets de nos CNP in vivo dans un modèle d’AVC réalisé chez la souris et qui consiste à induire la formation d’un caillot dans une artère cérébrale. Dans ce modèle, nous étudierons la capacité de nos CNP@PEG-DNase à dégrader le caillot et améliorer la reperfusion par le r-tPA, ainsi que leur effet sur le volume des lésions cérébrales et les déficits neurologiques des animaux. La pertinence de notre stratégie est renforcée par la publication récente de résultats montrant l’intérêt du greffage de la DNase I sur des nanoparticules (Zhang Tet al. DNase I-Mediated Chemotactic Nanoparticles for NETs Targeting and Microenvironment Remodeling Treatment of Acute Ischemic Stroke. Adv Sci (Weinh). 2025; 12:e03689) ou des nanoclusters (Sun J et al. DNase1 Mimic TMNCs Disrupt Neutrophil Extracellular Traps and Free Radical Circulation for Ischemic Stroke Therapy. Adv Healthc Mater. 2025; 14) pour le traitement de l’AVC.

L'accident vasculaire cérébral ischémique (AVCi) résulte de l'obstruction thrombotique des artères cérébrales conduisant à un dysfonctionnement neurologique, et constitue la deuxième cause de mortalité et la première cause d'invalidité acquise en France et en Europe. L'objectif premier du traitement de l'AVC est donc de rétablir à temps le flux sanguin dans l'artère obstruée. Actuellement, le r-tPA (activateur tissulaire recombinant du plasminogène), un agent thrombolytique, est utilisé à cette fin. Cependant, les contre-indications liées à l'âge ou au retard de la mise en place du traitement ont limité son utilisation à moins de 15 % des patients. En outre, une recanalisation artérielle précoce avec de bons résultats et une mortalité réduite n'est obtenue que dans un tiers des cas traités. Le mécanisme de cette résistance à la thrombolyse par le r-tPA reste inconnu. Une attention particulière a récemment été accordée à la présence de fibres d'ADN ou NETs (pièges extracellulaires à neutrophiles) enchevêtrées dans le maillage de fibrine du caillot. Comme les fibres d'ADN sont résistantes à l'effet de la plasmine, leur présence dans le caillot pourrait expliquer l'échec du r-tPA à lyser les thrombus. Dans ce projet, nous visons à évaluer l'impact de la DNase I, une enzyme nucléolytique spécifique, sur la lyse des thrombus comme adjuvant du traitement au r-tPA. Notre hypothèse est que le traitement concomitant avec le r-tPA et la DNase I spécifiquement ciblée sur le thrombus contribuera à une stratégie thrombolytique efficace et sûre. L'hydrolyse simultanée de l'ADN et de ses protéines de base par l'activité protéolytique et nucléolytique combinée de la DNase I et de la plasmine générée localement semble nécessaire pour désintégrer les NETs.
L'objectif principal de notre projet est d'utiliser des systèmes à base de nanoparticules qui transportent la DNase I active et qui s'accumulent préférentiellement sur le caillot en les équipant de ligands qui reconnaissent la fibrine présente au sein du caillot. Afin de développer de nouveaux nanovecteurs répondant à ces caractéristiques, nous proposons l'utilisation de nanoparticules d'oxyde de cérium (CeO2 ou nanoceria) sur lesquelles la DNase I sera greffée. Les nanocristaux d'oxyde de cérium sont des particules non stoechiométriques avec des cations tri et tétravalents Ce3 + et Ce4 + à leur surface. La coexistence de deux états d'oxydation confère à ces particules des propriétés catalytiques remarquables, leur activité étant similaire à celle des enzymes catalase, superoxyde dismutase ou peroxydase. Il a été démontré que les processus catalytiques impliquant des nanoceria de taille inférieure à 10 nm conduisent à la décomposition d'espèces réactives de l'oxygène. En recherche en amont, la nanoceria ont été utilisée comme agents thérapeutiques dans le traitement du stress oxydant associé à des pathologies telles que la cardiomyopathie, la septicémie, la sclérose en plaques. Or, au cours d'un AVC, un stress oxydant survient et contribue aux lésions neuronales et vasculaires; ces dernières sont particulièrement délétères pour les patients car elles conduisent à des hémorragies intracérébrales. De plus, lors de la recanalisation, l'apport sanguin en oxygène peut aggraver ce phénomène. Les CNPs avec leurs propriétés anti-oxydantes pourront donc protéger les vaisseaux lors de la recanalisation et réduire l'apparition des hémorragies cérébrales. Notre approche est complémentaire de la fibrinolyse obtenue par le r-tPA en se concentrant sur les NETs et le stress oxydant à l'aide de nanoparticules d'oxyde de cérium bifonctionnelles portant l'activité de la DNase I.