Signalisation des lipides du microbiote sur l'hôte – MILI

L’objectif de notre projet était d’étudier le rôle des acides gras à longue chaîne (LCFA) dans la douleur viscérale. Comme décrit dans notre plan de travail, nous avons mis au point plusieurs modèles murins du syndrome de l’intestin irritable (SII) et procédé à la quantification des LCFA d’origine bactérienne ainsi qu’à l’analyse de l’expression de leurs récepteurs potentiels chez la souris. Trois modèles ont été développés : un modèle de stress prénatal, induisant une douleur viscérale chez la descendance ; un modèle de SII post-inflammatoire, avec apparition de douleur 30 jours après résolution de la colite ; et un modèle de stress chez l’adulte, où une douleur viscérale persistait de 7 jours à 3 mois après le stress d’évitement de l’eau. Dans ces différents modèles, nous n’avons pas observé de variation significative des concentrations de LCFA ni de l’expression de leurs récepteurs. Nous avons donc réorienté notre analyse vers une autre famille de lipides bactériens : les acides biliaires. Nous avons mis en évidence des différences de concentration en acides biliaires fécaux entre les différents modèles murins. Grâce à la spectrométrie de masse à haute résolution, nous avons identifié de nouveaux acides biliaires secondaires et validé une méthode de quantification intégrant ces nouvelles molécules. Par ailleurs, profitant de l’accès à des échantillons humains, nous avons mesuré les acides biliaires dans les fèces de volontaires sains et de patients atteints de SII. Nous avons constaté une augmentation d’un nouvel acide biliaire secondaire : l’acide 3β-cholique. Nous avons démontré que cet acide biliaire secondaire nouvellement identifié est un agoniste biaisé de TGR5.

Les patients atteints du syndrome de l’intestin irritable (SII) présentent une altération du profil fécal en acides biliaires secondaires, identifiée par spectrométrie de masse LC-MS/MS (Figure 1). En stratifiant les patients selon la sévérité du SII à l’aide du score de Francis, une analyse de regroupement hiérarchique des métabolites bactériens a révélé que les profils en acides gras à chaîne courte (AGCC, Figure 1A) et lipoamines (LpAA, Figure 1B) ne permettaient pas de distinguer clairement les patients SII des volontaires sains. En revanche, l’analyse des acides biliaires (Figure 1C) séparait nettement les patients SII (toutes sévérités confondues) des témoins sains. Parmi ces acides biliaires, l’iso-lithocholique (isoLCA) était diminué chez les patients SII sévères, alors que le 3-oxo-lithocholique (3oxoLCA) et le 3β-cholique (3βCA), isomère du cholique (CA, Figure 2A), étaient augmentés (Figures 2B et 2C). L’isoLCA présentait une corrélation négative significative avec la douleur (Figure 3A), tandis que seul le 3βCA montrait une corrélation positive marquée avec les scores de douleur (r = 0,49 ; p = 0,002 ; Figure 3C), sans lien avec les scores de diarrhée ou de constipation (Figures 3D-E). Pour évaluer la spécificité de cette association, la concentration fécale de 3βCA a été mesurée chez des patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) ou d’insuffisance pancréatique exocrine (IPE). Seuls les patients SII présentaient une augmentation significative du 3βCA par rapport aux témoins sains (Figure 4A). Ni l’activité des MICI (stratifiée par la calprotectine, Figure 4B), ni celle de l’IPE (stratifiée par l’élastase, Figure 4C) n’étaient associées à des variations de 3βCA. De plus, aucune corrélation n’était observée entre 3βCA et ces marqueurs (Figure 5), suggérant une spécificité du 3βCA pour la douleur viscérale du SII. Expérimentalement, une injection intracolique de 3βCA chez la souris induisait une hypersensibilité viscérale, mesurée par une augmentation significative de la réponse viscéromotrice à la distension rectale (Figure 6). Ce comportement était accompagné d’une réduction de l’activité spontanée post-injection, suggérant un effet pro-algique du 3βCA. In vitro, le 3βCA ne déclenchait pas directement de signal calcique dans les neurones sensitifs, mais potentialisait la réponse de ceux-ci à l’agoniste TRPA1 (AITC), avec un effet significatif à 50 µM (Figures 7A-B), suggérant une sensibilisation du canal TRPA1. Cette sensibilisation dépendait du récepteur TGR5, car inhibée par l’antagoniste SBI-115, et impliquait les sous-unités Gβγ, comme démontré par l’effet de l’inhibiteur GRK2i (Figure 8). Ces résultats indiquent que le 3βCA, spécifiquement augmenté dans le SII, contribue à la douleur viscérale via une voie TGR5-Gβγ-TRPA1, en faisant une cible thérapeutique potentielle.

Ces travaux mettent en évidence l’importance cruciale de l’étude des métabolites bactériens issus du microbiote intestinal dans la compréhension des maladies digestives et systémiques. Ils encouragent à poursuivre cette approche pour mieux cerner le rôle du microbiote dans les mécanismes physiopathologiques. Dans cette perspective, nous avons obtenu un financement des fondations APICIL et Maladies Rares pour un projet intitulé : « Intérêt thérapeutique des métabolites issus du microbiote intestinal dans la douleur viscérale associée à la pseudo-obstruction intestinale chronique (POIC) chez l’enfant ». La POIC est une maladie rare de la motricité gastro-intestinale, caractérisée par des symptômes récurrents évoquant une occlusion intestinale, sans qu’aucun obstacle mécanique ne soit détectable à l’imagerie ou en chirurgie, et en l’absence de pathologie organique, systémique ou métabolique. Ce syndrome, possiblement influencé par le microbiote, est associé chez certains patients à des épisodes de douleurs viscérales particulièrement intenses. Les approches méthodologiques développées dans le cadre de notre projet ANR seront transposées à cette population pédiatrique afin d’identifier d’éventuels groupes de métabolites associés aux manifestations douloureuses, ouvrant ainsi la voie à de nouvelles pistes diagnostiques et thérapeutiques.

Le syndrome de l’intestin irritable (SII) représente la première cause de consultation chez le gastroentérologue. Le SII est caractérisé par des douleurs abdominales associées à des altérations des fonctions digestives. Il n’y a pas à l’heure actuelle de marqueur diagnostique de cette pathologie réduisant drastiquement la qualité de vie des patients, l’inclusion des patients dans les différents sous-groupes de SII se faisant à partir de questionnaires cliniques et par exclusion d’autres pathologies. Cette classification est une des causes de l’échec des essais cliniques dans ce groupe très hétérogène de patients. L’augmentation des connaissances vis-à-vis de cette pathologie et des moyens thérapeutiques représente donc un important challenge pour améliorer la prise en charge de ces patients. Des études récentes ont mis en évidence qu’un dysfonctionnement de la communication entre le microbiote intestinal et l’organisme hôte pourrait conduire au développement du SII. Ainsi, une meilleure compréhension des relations hôte-microbiote pourrait nous permettre d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques. De nombreux rapports ont établi un lien entre la pathogénicité du SII et la dysbiose du microbiote intestinal, une condition qui fait référence à la diminution / perte de la diversité et de la richesse microbiennes. Néanmoins, il existe une différence dans la composition bactérienne rapportée par les différentes études. En raison de l'absence d'un profil clair de dysbiose du microbiote intestinal dans le SII et d’une redondance fonctionnelle des bactéries au sein du microbiote, notre objectif principal est d'identifier les composés bactériens impliqués dans la régulation de la douleur associée au SII. Contrairement aux maladies inflammatoires de l’intestin, aucune augmentation de la translocation bactérienne n’a pu être observée chez ces patients indiquant que si les bactéries ont un impact sur la douleur viscérale, cela se fait via l’action des molécules sécrétées et/ou transformées par les bactéries sur l’homéostasie intestinale. Comme beaucoup de lipides sont capables de traverser la barrière intestinale, nous nous sommes attachés à caractériser les métabolites lipidiques bactériens.
Dans une étude précédente nous avons démontré que des lipopeptides synthétisés par des bactéries pouvaient réguler l’activité des nerfs sensitifs. Récemment, nous avons quantifié dans le microbiote des acides gras à longue chaine (AGLC) capable de réguler des fonctions des cellules épithéliales intestinales. Nous avons notamment caractérisé un AGLC hydroxylé en positon 3, le C18-3OH, capable d’activer le récepteur nucléaire PPAR. L’objectif de notre projet est donc d’étudier le rôle des AGLC produits par le microbiote dans la pathogénicité du SII et leurs mécanismes d’action sur l’hôte. Dans un premier objectif, nous établirons le lien entre la dysbiose du microbiote intestinal et la douleur viscérale en caractérisant l’implications des récepteurs nucléaires PPAR dans un modèle murin de SII. Puis nous quantifierons les AGLC bactériens et l’abondance des bactéries du microbiote lors de la genèse du SII chez la souris. La corrélation entre ces deux paramètres (souche bactérienne et composés lipidiques) et les symptômes des souris devrait nous permettre de caractériser les AGLC et les bactéries impliqués dans la pathogénicité du SII. Dans une dernière partie de notre projet, nous déterminerons les propriétés agonistes des AGLC bactériens sur les PPAR. Puis in vivo, chez l’animal, nous évaluerons le potentiel thérapeutique des AGLC et des bactéries impliquées dans leur production. Ce projet reposant sur la complémentarité des différents partenaires devrait permettre une meilleure caractérisation de la pathogénicité du SII. Notre consortium offre une occasion unique de comprendre les mécanismes d’action de ces AGLC bactériens sur la douleur pour ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le SII.