Quand les organites sculptent le noyau: contrôle de l'architecture chromatinienne par le plaste – PlastoNuc

Pour atteindre ces objectifs, le projet a combiné des outils d’imagerie avancés, des techniques épigénomiques quantitatives, des analyses cellulaires ciblées et des collaborations avec des plateformes de cytométrie, d’imagerie photonique, et des équipes spécialisées en apprentissage profond. Ces approches ont permis de quantifier les défauts nucléaires induits par l’inhibition de l’expression des gènes plastidiaux, tout en explorant les mécanismes sous-jacents.

1. Imagerie et segmentation automatisée des noyaux et foci d’hétérochromatine

Nous avons utilisé la microscopie confocale, couplée à un marquage au DAPI pour visualiser l’ADN. Le développement d’outils d’analyse automatisés a été essentiel pour analyser les nombreux mutants et inhibiteurs :

- Nucl.Eye.D : Un outil d’apprentissage profond développé en collaboration avec l’équipe de Jean Molinier (IBMP, Strasbourg) pour segmenter automatiquement les noyaux et leurs foci hétérochromatiniens à partir de milliers d’images confocales. Bien que performant sur des noyaux standards, cet outil a échoué à identifier les foci dispersés dans nos conditions.

- iCRAQ : Un plugin pour ImageJ permettant une segmentation semi-automatisée avec curation manuelle, spécialement conçu pour analyser les noyaux présentant des défauts d’hétérochromatine.

2. Caractérisation de la distribution nucléaire des marques épigénétiques et des domaines hétérochromatiniens du génome

Pour comprendre les mécanismes épigénétiques sous-jacents, nous avons utilisé des approches complémentaires :

- Immunolocalisation : Marquage des noyaux avec des anticorps spécifiques aux marques hétérochromatiniennes et à la méthylation de l’ADN, suivi d’une analyse par microscopie confocale.

- DNA-FISH : hybridation in situ à l’aide de sondes spécifiques des régions centromériques.

- Tri des noyaux par ploïdie : En collaboration avec la plateforme de cytométrie de l’I2BC, nous avons trié les noyaux en fonction de leur niveau de ploïdie afin d’analyser spécifiquement les cellules polyploïdes.

3. Profilage épigénomique et transcriptomique quantitatif

Pour identifier les changements globaux dans l’épigénome et le transcriptome, nous avons développé et utilisé des méthodes normalisées :

- ChIP-Rx : Une version modifiée du ChIP-seq incluant une normalisation externe par spike-in permettant de quantifier les changements globaux dans les marques épigénétiques.

- RNA-Rx : Nous avons développé une approche similaire à l’ARN-seq, utilisant également un spike-in pour normaliser les variations de la taille globale du transcriptome.

- Normalisation par nombre de cellules : Pour corriger les biais liés aux différences de taille ou de nombre de cellules entre échantillons, nous avons développé une méthode de clarification des organes entiers couplée à un comptage automatisé des noyaux (via le logiciel Arivis pro). Cela a permis d’ajuster les données transcriptomiques en fonction du nombre effectif de cellules analysées.

L’inhibition de l’expression des gènes plastidiaux provoque une désorganisation majeure de l’hétérochromatine dans les noyaux des cotylédons d’Arabidopsis thaliana : multiplication des foci d’hétérochromatine et un aspect dispersé.

Les analyses par DNA-FISH ont révélé des effets spécifiques au niveau des centromères affectant particulièrement les noyaux polyploïdes.

Malgré la dispersion de l’hétérochromatine, les analyses transcriptomiques n’ont pas mis en évidence de réactivation significative des éléments transposables. Des défauts globaux des marques épigénétiques ont été observés, et leur possible lien avec les défauts cytologiques est en cours d’étude.

Les défauts nucléaires sont restreints aux organes et aux tissus photosynthétiques, bien qu’il ne semble pas exister de lien direct entre l’activité photosynthétique et la désorganisation de l'hétérochromatine. Ni GUN1 (voie rétrograde centrale du chloroplaste) ni la voie des tétrapyrroles ne semblent non plus responsables des défauts observés. D’autres voies par lesquelles l’inhibition de l’expression des gènes plastidiaux pourrait affecter l’organisation chromatinienne à grande échelle sont en cours d’étude. Dans ce cadre, l’exploration fine de différents acteurs de l’expression des gènes plastidiaux a mis en évidence l’implication spécifique des deux ARN polymérases chloroplastiques (PEP et NEP) ainsi que de certains facteurs associés.

Les résultats obtenus au cours de ce projet ouvrent la voie à une meilleure compréhension des mécanismes épigénétiques liés à l’activité des organites, avec des retombées potentielles pour l’amélioration des cultures et la recherche fondamentale sur l’adaptation des plantes. En identifiant les acteurs clés de ce dialogue chloroplastes-noyau, il pourrait inspirer de nouvelles stratégies pour renforcer la résilience des plantes face aux stress environnementaux. La mise en évidence du rôle d'un organite bioénergétique de la cellule sur les réarrangements chromatiniens ouvre également des perspectives pour l'exploration de liens mitochondrie / 3D génome chez les plantes, mais aussi chez les autres eukaryotes.

Le rôle joué par les dynamiques de l'organisation nucléaire dans la spécialisation cellulaire fait l'objet de nombreuses études chez un nombre croissant d'organismes eucaryotes, notamment pour déterminer les liens fonctionnels entre les redéploiements de l'organisation spatiale de la chromatine et l'instruction de nouveaux programmes transcriptionnels. PlastoNuc vise à identifier les acteurs moléculaires et les voies de signalisation contrôlant ce type de mécanismes de régulation chromatiniens au cours de réponses adaptatives des plantes à l'environnement. Le projet se focalise sur une transition développementale clé pour le cycle de vie des plantes, la photomorphogenèse (ou dé-étiolement). Cette transition entièrement dépendante de voies de signalisations lumière nécessite une reprogrammation rapide et à grande échelle de l'expression des gènes pour induire la biogenèse de chloroplastes photosynthétiques et la mise en place de la photo-autotrophie, impliquant une signalisation réciproque entre organites. Nous avons précédemment établi chez Arabidopsis thaliana que la perception de la lumière par des photorécepteurs nucléaires induit une compaction de la chromatine pendant le développement de la feuille embryonnaire (cotylédon). Cette transition s'accompagne aussi d'une augmentation générale de l’activité transcriptionnelle. Ces deux dynamiques nucléaires sont probablement impliquées dans le passage de la cellule d'un état métabolique "quiescent" à "actif", mais leurs relations fonctionnelles sont encore inconnues. S'appuyant sur des changements de grande ampleur synchronisés dans une population homogène de cellules, cette transition développementale constitue un système idéal pour étudier le couplage entre état métabolique, conformation du génome et régulation globale de la synthèse des ARNm.
Dans ce contexte, j'ai récemment identifié un rôle encore totalement inexploré des plastes dans la modulation de l'architecture nucléaire. PlastoNuc propose d'aborder ce nouveau cadre conceptuel en explorant l’implication des signaux plastidiaux dans l'état transcriptionnel et chromatinien du noyau. Les voies de signalisation qui seront explorées comprennent les voies rétrogrades plaste-noyau, la signalisation par les sucres et les métabolites dérivés du plaste servant de cofacteurs ou de substrats à des modificateurs de la chromatine. La contribution de ces voies à la compaction de la chromatine et au régime transcriptionnel sera disséquée à l'aide de lignées d'Arabidopsis mutantes et de conditions de culture spécifiques. En complément, une approche agnostique reposera sur le développement d'un système rapporteur de la processivité de l'ARN Pol II pour réaliser un crible génétique. Après avoir identifié les voies plastidiales impliquées, je déterminerai leur impact sur la composition et l'organisation spatiale de la chromatine. Les conséquences transcriptionnelles seront étudiées par de nouvelles méthodologies que j’ai récemment mises au point permettant une quantification absolue et à l'échelle du génome de l'abondance des transcrits. Enfin, l'impact des contrôles chromatiniens médiés par le plaste sur le développement post-germinatif des plantes sera déterminé par la combinaison de phénotypages et d’analyses métabolomiques.
Au-delà de son intérêt en recherche fondamentale, en se focalisant sur un facteur vital influençant les agrosystèmes (la lumière), PlastoNuc est pertinent pour les recherches sur l’amélioration de la vigueur des semis et la prédiction des conséquences indésirables de l'amélioration de la photosynthèse, une stratégie actuellement fortement développée pour la production de biomasse. Les plantes et les mammifères partageant de nombreuses voies épigénétiques, PlastoNuc peut enfin contribuer aux efforts de compréhension des mécanismes de spécification des cellules souches et cancéreuses, dans lesquelles les liens entre métabolisme, organisation chromatinienne et hypertranscription jouent aussi des rôles prépondérants.