Un rôle nouveau de la cavéoline dans le transport de la sphingomyéline à la membrane plasmique – CAV-SM

Objectif 1 : Caractérisation in cellulo du tri de la SM dépendant de Cav1 au TGN.

La sonde Eqt-SM (équinatoxine) a montré que les cellules dépourvues de cavéoline présentent une diminution de la SM à la membrane plasmique (MP). Le contenu en SM sera mesuré dans des cellules endothéliales pulmonaires murines WT et Cav1 KO par spectrométrie de masse lipidique. Le trafic intracellulaire de la SM sera suivi à l’aide de constructions RUSH de Cav1 et d’Eqt, permettant de synchroniser le transport RE–TGN–MP et de réaliser une imagerie quantitative en cellules vivantes. La microscopie TIRF sera utilisée pour comparer la cinétique et l’ampleur de l’acheminement de la SM vers la MP. Afin d’évaluer le rôle de la SM dans l’assemblage de Cav1, nous inhiberons la synthèse des sphingolipides (myriocine, siRNA SMS1/2) et analyserons l’abondance des cavéoles par microscopie optique et électronique ainsi que le bourgeonnement des vésicules positives pour Cav1 à partir du TGN.

Objectif 2 : Caractérisation in vitro de l’organisation de Cav1 par cryo-ME.

Nous ferons varier la densité protéique et la composition lipidique (cholestérol, SM), puis analyserons les populations vésiculaires séparées par gradients de saccharose. La cryotomographie électronique caractérisera les déformations membranaires à l’échelle nanométrique. Le moyennage de sous-tomogrammes fournira des informations structurales sur Cav1 associée à la membrane à une résolution d’environ 1–2 nm, reliant forme membranaire, composition lipidique et organisation de Cav1.

Objectif 3 : Analyse in vitro du tri de la SM assisté par Cav1.

La sensibilité de Cav1 à la courbure membranaire sera quantifiée par extraction de GUV-nanotubes en combinant pinces optiques, aspiration par micropipette et microscopie confocale. La courbure sera contrôlée par la tension membranaire et l’enrichissement de Cav1 mesuré par fluorescence. Nous mesurerons la courbure intrinsèque de Cav1 et le co-tri de Cav1 et de la SM dans des GUV contenant DOPC, cholestérol et SM à l’aide de colorants sensibles à l’environnement lipidique et d’Eqt fluorescente. Les effets de la SM sur la partition de Cav1 seront également quantifiés.

Objectif 4 : Rôle du couplage trans-bicouche dans le tri de la SM.

Pour étudier le couplage entre les feuillets membranaires, la synthèse de PS e/ SM sera perturbée (inhibiteurs chimiques, siRNA) et les effets sur le bourgeonnement de Cav1 et l’assemblage des cavéoles seront analysés. Le trafic de la SM sera suivi par RUSH et la déplétion de la SM à la MP combinée à l’imagerie de la PS. In vitro, des membranes asymétriques seront générées en reconstituant Cav1 dans un feuillet et en préparant des GUV à asymétrie lipidique définie. Après fusion avec des protéoliposomes contenant Cav1, la redistribution de la SM sera quantifiée par extraction de nanotubes. Enfin, des cavines purifiées seront ajoutées afin de reconstituer des structures de type cavéole dans ces systèmes asymétriques.

Ce projet a conduit à deux résultats majeurs. Le premier a donné lieu à une thèse de doctorat, désormais poursuivie par un postdoctorant. Le second constitue le travail principal d’un chercheur postdoctoral et est actuellement disponible sous forme de prépublication sur BioRxiv, avec une soumission à une revue majeure de biologie cellulaire en préparation.

Le projet de thèse visait à élucider la détection et l’induction de courbure par la cavéoline. La thèse, intitulée « Caveolin in membrane nanotubes: curvature sensing and bulge formation », a été soutenue par Zhi-Qian Wu le 7 juin 2024. Dans ce travail, la caveoline-1 (Cav1) a été reconstituée dans des vésicules géantes unilamellaires (GUV), et des expériences d’extraction de nanotubes ont été réalisées. Les résultats montrent que la cavéoline est une protéine sensible à la courbure : les complexes 8S de Cav1 présentent une inclinaison intrinsèque (~5°), conférant une sensibilité à la courbure membranaire. Ces complexes peuvent également induire de la courbure, générer des déformations à faible tension et former des échafaudages à tension plus élevée.

De manière intéressante, au-delà d’un seuil de tension (Tt), dépendant de la densité de Cav1, les nanotubes ne maintiennent plus un rayon constant et présentent des bourgeonnements induits par Cav1. La taille de ces bourgeons diminue avec l’augmentation de la tension et dépend de la quantité totale de Cav1, suggérant une densité protéique constante dans ces structures. Une densité membranaire plus élevée de Cav1 favorise leur formation et abaisse Tt. Ces résultats suggèrent que Cav1 se réorganise en structures bourgeonnantes pour relâcher les contraintes mécaniques dans les membranes fortement courbées, bien qu’un modèle mécanistique et des approches d’imagerie à haute résolution restent nécessaires.

Le second résultat majeur concerne le rôle de Cav1 dans le trafic de la sphingomyéline (SM) vers la membrane plasmique. Ce travail, dirigé par Johanna Podkalicka (postdoctorante commune aux trois laboratoires), est disponible en prépublication sur BioRxiv (DOI: 10.1101/2025.10.01.679304). Nous montrons que dans les cellules KO pour Cav1, les sphingolipides complexes sont redirigés vers les lysosomes au lieu de la MP, un phénotype absent dans les cellules KO pour Cavin-1, indiquant un rôle indépendant des cavéoles. Le défaut de trafic provient de l’endosome de tri, où les sphingolipides n’entrent pas dans les tubules de recyclage destinés à la MP. Ce défaut est corrigé par la surexpression de Cav1, mais pas par un mutant dépourvu de sites de S-palmitoylation. Ces résultats indiquent que la Cav1 palmitoylée, non associée aux cavéoles, agit comme un facteur de chaperonnage ou de sélection, facilitant l’incorporation des sphingolipides dans les transporteurs de recyclage et contribuant ainsi à la composition de la membrane plasmique.

Nous avons soumis un nouveau projet ANR dans la continuité du projet CAV-SM. Nous avons construit une proposition hautement interdisciplinaire combinant des approches biophysiques, structurales, de biologie cellulaire et d’imagerie innovantes pour comprendre comment la caveoline-1 (Cav1), principale protéine membranaire des cavéoles, interagit avec les membranes cellulaires, les déforme et en module les fonctions. La perte de cavéoles est impliquée dans de nombreuses maladies humaines ; ce projet est donc non seulement fondamental en biologie cellulaire, mais aussi pertinent sur le plan médical. Cav1 et les protéines cavin (qui forment une coiffe périphérique des cavéoles) sont étudiées depuis des décennies, mais leur mode d’assemblage reste encore largement incompris. Cav1 est une protéine difficile à étudier : elle s’oligomérise dans la membrane, interagit avec les lipides et induit des déformations membranaires ; elle présente des fonctions à la fois dans et hors des cavéoles et est transportée entre différents compartiments intracellulaires, où elle dépend parfois de cavin1 pour former des cavéoles (membrane plasmique), mais fonctionne de manière indépendante dans d’autres contextes (ex. gouttelettes lipidiques). Notre projet propose une approche intégrative visant à analyser de manière quantitative et mécanistique comment une seule protéine, Cav1, s’adapte à ces différents environnements membranaires et y exerce ses fonctions.

Nous proposons l’utilisation de systèmes de reconstitution in vitro (ex. GUV), d’approches biophysiques (tirage de nanotubes membranaires) et d’imagerie (cryo-EM/ET et microscopie optique haute résolution, ex. STORM) afin d’étudier l’insertion de Cav1 dans les membranes et sa capacité à les reconnaître et les déformer. Ces approches seront complétées par des analyses de biologie cellulaire (expression et imagerie de mutants, perturbations mécaniques et des lipides). Nous utiliserons également des outils établis, comme le système RUSH, pour analyser les défauts de trafic induits par des mutations ponctuelles de Cav1. Les fonctions de cavin1, EHD2 et Pacsin2 seront également étudiées dans le cadre du projet.

Le tri des lipides et des protéines est un processus fondamental pour l'identité et les propriétés des différents organites cellulaires. La sphingomyéline (SM) joue un rôle clé à la membrane plasmique (MP) dans l'organisation de nanodomaines, comme les radeaux lipidiques et les cavéoles. La perturbation de la biosynthèse ou du trafic de SM est retrouvée dans des pathologies humaines comme le cancer et les maladies cardiovasculaires. La SM est synthétisée au niveau du Trans-Golgi (TGN) puis transportée à la PM. Cependant, la manière dont la SM est triée au TGN puis transportée à la PM n'est pas encore comprise. En effet, comme les membranes riches en SM sont rigides, le mécanisme connu de tri des lipides par la courbure membranaire, basé sur la minimisation de l'énergie mécanique, ne peut pas expliquer l'enrichissement en SM de la MP. Notre hypothèse est que le mécanisme de tri des SM met en jeu l'assistance de protéines, qui doivent ainsi avoir une affinité pour les membranes courbées et la SM. C'est le cas de la cavéoline 1 (Cav1) qui est enrichie dans la voie de sécrétion. Nos données préliminaires montrent en effet que les cellules KO pour Cav1 présentent une diminution significative de la quantité de SM à la MP.

Notre objectif est de déterminer les mécanismes moléculaires et la contribution de la SM dans l'assemblage de Cav1 au TGN, ainsi que le rôle de Cav1 dans le trafic de SM du TGN vers la MP. Nous testerons deux hypothèses : (i) SM est nécessaire à l'assemblage correct de Cav1 et à son oligomérisation au TGN (ii) Cav1 permet l'incorporation de SM dans les vésicules bourgeonnant au TGN et transportées à la MP.
Nous étudierons in cellulo le tri de SM dépendant de Cav1, en utilisant le système RUSH (retention using selective hooks) qui permet un trafic synchronisé et une libération contrôlée du réticulum endoplasmique de Cav1 et de SM marquée par l'Equinatoxine. La Tâche 1 décrira le bourgeonnement vésiculaire et le transport jusqu'à la MP. Dans les Tâches 2 et 3, le tri sera étudié avec des systèmes in vitro, grâce à notre récente reconstitution de Cav1 dans des vésicules unilamellaires, petites et géantes (GUVs), un challenge jamais réalisé auparavant. Dans la Tâche 2, nous utiliserons la cryo-microscopie électronique pour étudier l'organisation 3D de Cav1 sur les membranes, son effet sur la déformation des membranes et sa dépendance à SM. La Tâche 3 déterminera si Cav1 et SM sont enrichies synergistiquement dans les membranes courbées, par des expériences de nanotubes membranaires tirés de GUVs contenant Cav1. Enfin, puisque Cav1 est hémi-membranaire et insérée dans le feuillet interne de la MP alors que SM est essentiellement dans le feuillet externe, la Tâche 4 abordera la question de l'asymétrie membranaire. Nous étudierons le couplage trans-bicouche à la fois in cellulo, en perturbant chacun des composants potentiellement impliqués et en observant le tri et le transport intracellulaire ultérieurs, et in vitro, en adaptant des protocoles existants pour la préparation de membranes modèles asymétriques, avec Cav1 reconstituée de manière unidirectionnelle dans un feuillet et SM dans le feuillet opposé.

Les 3 partenaires qui ont déjà collaboré apporteront une combinaison unique d'expertise en biologie cellulaire, biophysique et biologie structurelle. P1 a démontré le rôle primordial de Cav1 dans la réponse mécanique des cellules, P2 a déchiffré des mécanismes de tri des lipides et de protéines dans les membranes courbées, et P3 a étudié l'architecture 3D de protéines membranaires à l'échelle moléculaire.
Le projet CAV-SM jettera un nouvel éclairage sur le rôle joué par les caveolae/cavéolines dans le transport des lipides et donc, dans l'homéostasie des lipides et l'organisation des MP. Il abordera donc des questions qui sont non seulement centrales en biologie cellulaire fondamentale, mais aussi pertinentes dans plusieurs maladies impliquant les caveolae, notamment le cancer, l'athérosclérose et les myopathies.