Décrypter les mécanismes impliqués dans l'hyperaccumulation de métaux alcalino-terreux par les cyanobactériesphering the mechanisms involved in the hyperaccumulation of alkaline earth metals by cyanobacteria – HARLEY

Le projet HARLEY a été très interdisciplinaire, combinant une diversité d’approches classiquement utilisées par des disciplines scientifiques distinctes. Ainsi, pour explorer ce processus unique, nous avons fait appel à la génétique, la bioinformatique, la biochimie, ainsi que des outils de microscopie et de spectroscopie développés pour la minéralogie.

Nous avons cherché à confirmer l’implication du gène ccyA dans la formation des minéraux carbonatés intracellulaires. Pour cela, nous avons grâce à la génétique : (i) désactivé ce gène dans des cyanobactéries biominéralisatrice pour en observer l’effet. (ii) au contraire, fait exprimer le gène à haute dose dans des bactéries incapables de réaliser cette biominéralisation ou dans d’autres qui en sont capables afin de déterminer si cela amplifie le phénomène. Pour mettre en œuvre ces approches de génétique, nous avons sélectionné les souches bactériennes les plus adaptées aux modifications génétiques, en testant leur croissance et leur sensibilité aux antibiotiques. Ensuite, nous avons testé diverses techniques (conjugaison, transformation naturelle, électroporation et CRISPR-Cas12a) pour insérer ou supprimer le gène ccyA.

Par ailleurs, l’équipe de l’ANR HARLEY a développé un outil informatique pour automatiser la recherche du gène ccyA dans les bases de données génomiques publiques, qui sont déjà immenses mais de plus continuent à s’enrichir en permanence. Cet outil analyse la structure des protéines associées et permet de repérer les variantes de ccyA chez d’autres micro-organismes. Nous avons de plus utilisé l’intelligence artificielle et notamment le logiciel AlphaFold pour prédire la structure 3D des protéines impliquées.

Parallèlement, une partie du projet visait à produire et purifier la protéine calcyanine, codée par le gène ccyA, pour comprendre son rôle exact. Nous avons fait produire le plus efficacement possible cette protéine par une autre bactérie, la bactérie E. coli, en y insérant le gène ccyA. Puis nous avons testé différentes méthodes de purification et d’analyse de la structure de la protéine grâce à des techniques avancées de chromatographie, spectrométrie de masse, et diffusion des rayons X.

Enfin et s’appuyant sur des compétences développées par des minéralogistes, des géochimistes et des microbiologistes du consortium, nous avons utilisé des outils sophistiqués pour visualiser et analyser la formation des iACC. Notamment, nous avons utilisé la microscopie électronique pour observer la structure des minéraux intracellulaires à très petite échelle, des techniques de spectroscopie et de spectrométrie de masse pour étudier leur composition chimique et isotopique, et enfin nous avons mis en place des expériences de culture pour quantifier les taux de prélèvement du calcium par les cyanobactéries et estimer comment les carbonates intracellulaires se forment dans différentes conditions.

Le projet HARLEY a permis de mieux comprendre comment certaines cyanobactéries fabriquent de minuscules précipités de carbonate de calcium à l'intérieur de leurs cellules. Voici une série de résultats importants auxquels nous avons abouti au cours de ces quatre années de recherche :

Une découverte majeure a été l’identification d’un gène clé, appelé ccyA, qui code pour une protéine nommée calcyanine. Ce gène est présent chez toutes les cyanobactéries capables de former ces cristaux et même chez d'autres bactéries non cyanobactériennes, elles aussi capables d’une telle biominéralisation. L’analyse de son ancienneté dans le génome des cyanobactéries indique que ce processus de biominéralisation existe depuis plusieurs milliards d’années.

Ensuite, grâce à des analyses bioinformatiques, nous avons découvert que la calcyanine possède deux parties distinctes : (i) un domaine très conservé en séquence présent chez toutes les cyanobactéries et (ii) un domaine plus variable qui pourrait jouer dans certains cas au moins jouer un rôle dans des liens entre cette protéines et des lipides membranaires.

Nous avons déterminé comment la calcyanine agit en introduisant le gène ccyA dans une cyanobactérie modèle, Synechococcus elongatus, qui ne produit pas naturellement de minéraux intracellulaires. Résultat : ces bactéries génétiquement modifiées ont accumulé plus de calcium. D’autres expériences ont été menées pour supprimer le gène ccyA dans une cyanobactérie qui le possède naturellement. Cela a entraîné une diminution, voire une disparition des minéraux, confirmant le rôle essentiel de ce gène dans la biominéralisation.

En analysant l’expression de ccyA au fil du temps, nous avons découvert qu’elle était plus active la nuit. De plus, ccyA semble fonctionner avec d'autres gènes impliqués dans le transport du calcium, ce qui renforce l'idée que la calcyanine joue un rôle clé dans la régulation de cet élément dans la cellule.

En exposant des bactéries à du radium 226, un isotope radioactif et toxique, nous avons observé qu’il était efficacement piégé à l’intérieur des précipités de carbonate de calcium, même en présence d’autres éléments similaires. Ce processus pourrait donc être utilisé pour dépolluer des eaux contaminées.

En utilisant des techniques avancées, notamment basées sur le rayonnement synchrotron, nous avons déterminé la géométrie de l’arrangement des atomes dans les précipités de carbonate de calcium et constaté qu’elle ressemblait à celle d’un minéral connu de carbonate hydraté. Ceci nous a permis de tirer des conclusions sur la stabilité des précipités formés, suggèrant que les cyanobactéries pourraient influencer ce paramètre.

Enfin, nous avons synthétisé les connaissances actuelles sur la biominéralisation bactérienne et exploré ses fonctions potentielles. Cette étude pose les bases pour de futures recherches afin de mieux comprendre pourquoi et comment les bactéries forment ces précipités, et quelles pourraient être les implications de ce phénom

Le projet HARLEY a permis d’importantes avancées scientifiques en identifiant un gène clé, ccyA, impliqué dans la formation de carbonates de calcium intracellulaires par les cyanobactéries. Cette découverte a révélé un mécanisme fondamental de gestion du calcium chez ces organismes et conduit à l’identification d’une nouvelle famille de protéines. HARLEY a aussi permis de développer d’outils génétiques et analytiques innovants pour étudier ces processus, ouvrant de nombreuses perspectives (i) aussi bien pour continuer les recherches qui permettront de comprendre de manière détaillée la façon dont ces bactéries forment de tels précipités et les utilisent, ainsi que les implications environnementales, mais aussi (ii) pour d’autres projets de recherche.

Quelques défis majeurs restent pour de futures recherches :

Un fragment de la protéine calcyanine a pu être cristallisé, mais sa taille est insuffisante pour une analyse fine de sa structure à l’échelle atomique. De nouvelles stratégies, comme la stabilisation avec des lipides ou des protéines partenaires, sont en cours pour obtenir une structure complète.

La suppression complète du gène ccyA dans les cyanobactéries s’est révélée difficile, suggérant son rôle essentiel à la survie des bactéries. Des approches alternatives, comme l’édition conditionnelle du gène via un interrupteur moléculaire ou l’interférence CRISPR, sont envisagées pour mieux comprendre sa fonction et ses effets sur la viabilité cellulaire.

Applications et projets associés

HARLEY a de plus inspiré et bénéficié à plusieurs autres projets déjà en cours :

• ANR CARBOMAGNET : Étudie d’autres bactéries que les cyanobactéries, capables de biominéraliser non seulement de carbonates de calcium intracellulaires mais aussi de nano-oxydes de fer magnétiques. Ces bactéries sont abondantes dans des environnements distincts de ceux des cyanobactéries

• Projet CaCO3 : Analyse l’impact écologique des cyanobactéries biominéralisantes, notamment celles produisant des toxines et affectant les écosystèmes aquatiques, avec des implications pour la gestion de la qualité de l’eau.

• Projet RADIONET : Explore l’utilisation des cyanobactéries pour capter des isotopes radioactifs présents dans les effluents de l’industrie nucléaire, une piste prometteuse pour la dépollution de sites contaminés.

• ANR CYANOMAN : Vise à décrypter d’autres acteurs moléculaires impliqués dans la biominéralisation pour potentiellement contrôler ce phénomène et ouvrir des applications industrielles ou environnementales.

En identifiant des mécanismes naturels performants de piégeage du calcium et des isotopes radioactifs, HARLEY ouvre la voie à des applications environnementales majeures. Ces avancées pourraient permettre de développer des solutions biologiques innovantes pour la dépollution, mais aussi d’approfondir notre compréhension des interactions entre bactéries et minéraux dans les cycles géochimiques.

Nous avons à ce jour publié un article de revue sur les mécanismes moléculaires de la biominéralisation de CaCO3 par les bactéries. Et un article démontrant la possibilité de modifier génétiquement une souche de cyanobactérie formant des CaCO3 intracellulaire.
D'autres publications sont en cours de soumission et d'écriture sur la diversité des calcyanines au sein des cyanobactéries ainsi que la mesure de la concentration du calcium à nanoéchelle dans des bactéries par STXM.
Une partie de notre travail a aussi été présenté au cours d'une conférence keynote à la conférence internationale Goldschmidt.

1. Sigrid Görgen, Karim Benzerara, Fériel Skouri-Panet, Muriel Gugger, Franck Chauvat, Corinne Cassier-Chauvat (2021) The diversity of molecular mechanisms of carbonate biomineralization by bacteria. Discover Materials 1:2.
2. Chenebault C, Diaz-Santos E, Kammerscheit X, Görgen S, Ilioaia C, Streckaite S, Gall A, Robert B, Marcon E, Buisson DA, Benzerara K, Sassi JF, Cassier-Chauvat C, Chauvat F. A (2020) Genetic Toolbox for the New Model Cyanobacterium Cyanothece PCC 7425: A Case Study for the Photosynthetic Production of Limonene. Front Microbiol. 11:586601.
1. Keynote, Goldschmidt Conference. “Biomineralization of intracelllar amorphous calcium carbonates (ACC) by bacteria: molecular mechanisms, evolutionary history and environmental significance” Benzerara K, Bitard-Feildel T, Bolzoni R, Cassier-Chauvat C, Chauvat F, Dezi M, Duprat Elodie, Görgen S, Lefevre C, Lopez-Garcia P, Menguy M, Monteil C, Moreira David, Skouri-Panet F, Callebaut I.

Les cyanobactéries sont des organismes photosynthétiques diversifiés et très abondants qui utilisent la lumière pour fixer le CO2 atmosphérique et produire une biomasse considérable qui alimente une grande partie de la chaine alimentaire. Nous avons découvert récemment que certaines cyanobactéries forment des carbonates de calcium amorphes intracellulaires (iACC) et accumulent ainsi de très grandes quantités d’alcalino-terreux (AEEs) comme le Ca, Sr, Ba ou le Ra. Bien que cette accumulation massive intracellulaire interroge sur l’homéostasie particulière des AEEs par ces bactéries et offre des perspectives prometteuses pour remédier les pollutions radioactives en 90Sr et 226Ra, nous en ignorons les mécanismes. Grâce à une approche récente de génomique comparative, nous avons identifié un gène orphelin, nommé ccyA, vraisemblablement impliqué puisqu’il est présent chez toutes les cyanobactéries formant des iACC et absent des autres. Les prédictions bioinformatiques suggèrent que ccyA code une protéine nommée Calcyanine qui contient deux domaines protéiques présentant des similitudes mais aussi des différences claires avec d’autres domaines connus. Le projet Harley vise à déterminer les mécanismes biochimiques de l’accumulation intracellulaire et de l’homéostasie des AEEs chez les cyanobactéries formant des iACC et à comprendre le rôle de la Calcyanine. Il sera mené par un consortium interdisciplinaire regroupant des expertises en biochimie, biologie structurale, biophysique, biogéochimie, génétique et physiologie des cyanobactéries. Nous proposons de (1) caractériser les propriétés structurales et chimiques de la Calcyanine in vitro. La protéine et ses domaines séparés seront purifiés après expression en système hétérologue. Leurs structures seront déterminées par cristallographie des rayons X et cryo-microscopie électronique en transmission (MET). Leurs affinités pour le Ca, le Sr et le Ba seront mesurées et leur impact sur la précipitation des ACC sera analysé. (2) Caractériser la fonction de la Calcyanine in vivo. Nous éliminerons/complémenterons ccyA dans des souches formant des iACC et analyserons en détail le phénotype de toutes ces souches. Parallèlement, nous introduirons ccyA dans des souches modèles pour la génétique et ne formant pas d’iACC. La localisation de la Calcyanine sera déterminée par construction de fusions avec la protéine fluorescente GFP. Les phénotypes des mutants ainsi produits et notamment l’homéostasie des AEEs, seront analysés par des mesures de chimie des solutions, des analyses en MET et microscopie des rayons X à balayage en transmission. De plus, le Ca2+ libre sera mesuré par microscopie confocale à balayage laser dans des souches où nous aurons introduits des gènes rapporteurs du Ca. (3) Rechercher d’autres protéines impliquées dans la formation d’iACC par 3 approches : (i) mutagenèse aléatoire à l’aide de transposons, en discriminant les mutants d’intérêt par la diminution de leur densité cellulaire ; (ii) extraction et identification par spectrométrie de masse des protéines associées aux iACC; (iii) identification de protéines partenaires de la Calcyanine par co-immunoprécipitation. L’annotation structurale et fonctionnelle de ces protéines sera systématiquement entreprise par bioinformatique. En plus de faire progresser les connaissances sur l’homéostasie des AEEs dans ces cyanobactéries et des mécanismes de biominéralisation des iACC, les résultats du projet Harley seront de grand intérêt pour la biologie structurale du fait de la détermination de nouveaux repliements protéiques et de leur fonction ainsi que pour la microbiologie par le développement de nouveaux modèles génétiques manipulables dans les cyanobactéries. A plus long terme, le projet Harley sera aussi crucial pour le développement de nouveaux systèmes biomimétiques ou biosynthétiques pour une bioremédiation efficace de pollutions par les AEEs notamment radioactifs.