Décrypter les mécanismes impliqués dans l'hyperaccumulation de métaux alcalino-terreux par les cyanobactériesphering the mechanisms involved in the hyperaccumulation of alkaline earth metals by cyanobacteria – HARLEY

Le projet utilise une diversité de méthodes et approches. Une première série d'approche utilise divers outils de bioinformatiques pour évaluer la distribution de la calcyanine au sein de la diversité des cyanobactéries. Ce recensement permet aussi d'évaluer la diversité des séquences de calcyanine et aussi les motifs conservés. D’autres outils permettent la prédiction des structures des calcyanines. A ces approches se couplent des approches expérimentales qui par expressions hétérologues et purification de protéines permettent de produire des échantillons qui sont ensuite utilisés pour la détermination de structures soit après cristallisation et analyses en diffraction des rayons X, soit par microscopie électronique en transmission. Les protéines purifiées sont aussi utilisées pour des analyses des propriétés chimiques de la calcyanine, notamment son affinité pour les alcalino-terreux. Ces analyses couplent mesures en spectroscopie de fluorescence et spectrométrie de masse.
Une deuxième série d'approches utilise les techniques de la génétique. Une première méthode couple délétion et complémentation du gène codant la calcyanine. Une deuxième vise à introduire et exprimant ce gène dans des cyanobactéries ne formant pas de CaCO3 intracellulaire. La localisation cellulaire de la protéine sera assurée par l'utilisation de protéines recombinantes fusionnées avec une protéine fluorescente (type GFP). Les phénotypes de l'ensemble des mutants produits seront analysés par diverses approches de chimie des solutions visant à quantifier la séquestration d'éléments alcalino-terreux par les souches, et par des méthodes de microscopie et spectromicroscopie des rayons x ou électroniques visant à quantifier et localisation le calcium dans les cellules.
Enfin, des approches de mutagenèse aléatoire d'un côté et de co-immunoprécipitation seront menées pour identifier d'autres protéines que la calcyanine potentiellement impliquées dans la biominéralisation de CaCO3 intracellulaire.

A ce jour nous avons obtenu plusieurs résultats marquants.
- Nous avons mis en place un pipeline bioinformatique permettant de détecter automatiquement et d'annoter de manière experte la calcyanine au sein des génomes dans les bases de données. Ceci nous a permis d'accroitre dramatiquement la liste de calcyanines existant au sein des cyanobactéries ainsi que leur diversité.
- Ceci nous a permis de faire plusieurs prédictions structurales, notamment un découpage de la protéines en deux domaines et l'identification de motifs de repliement de la protéine. Nous avons notamment établi un modèle structural pour un nouveau domaine trouvé chez certaines calcyanines et affilié à la superfamille des domaines HMA
- Nous avons de plus pu proposer un scénario évolutif suggérant une origine ancienne de la calcyanine puis une transmission verticale, de pertes dans de nombreuses branches de l'arbre des cyanobactéries et quelques cas de transferts horizontaux.
- expérimentalement, nous avons réalisé 11 constructions pour exprimer différentes calcyanines dans E. coli ainsi que 3 constructions pour exprimer des domaines de la calcyanine chez E. coli.
- Pour la génétique, nous avons construit des cassettes de délétion des calcyanines de 2 souches de cyanobactéries formant des CaCO3 intracellulaires. Nous avons parallèlement construit des mutants de souches formant des CaCO3 intracellulaires surexprimant la calcyanine. Certains des mutants expriment une calcyanine fusionnée avec une protéine gfp.
Enfin, nous avons construit des mutants de souches ne formant pas de CaCO3 intracellulaire mais surexprimant la calcyanine.
-L'analyse des différents mutants est en cours mais nous avons d'ors et déjà montré l'effet de la surexpression de la calcyanine sur la croissance des souches formant des CaCO3 intracellulaires. Par ailleurs, nous avons mis au point des analyses aux seuils L2,3 du calcium avec la spectromicroscopie x synchrotron (STXM) permettant de quantifier la distribution du Ca dans les cellules et montrant un accroissement des contenus en Ca des mutants des souches ne formant pas de CaCO3 intracellulaires mais surexprimant la calcyanine.

Nos perspectives sont dans la lignée des objectifs établis au début du projet.
- Au niveau de la bioinformatique, nous espérons ajouter l'analyse de métagénomes environnementaux pour rechercher des calcyanines diverses. Nous souhaitons aussi rechercher les domaines seuls de la calcyanine dans les génomes et comprendre dans quelles autres protéines ils peuvent être impliqués. Enfin, nous poursuivons l'établissement de modèles structuraux prédictifs à l'aide de nouveaux outils.
- Pour la biochimie, nous continuons d'affiner les protocoles de purification et visons à comprendre comment pallier les problèmes de stabilité de la protéine. L'objectif reste d'obtenir la structure d'une ou plusieurs calcyanine. La confection d'anticorps polyclonaux est en cours et permettra aussi de nombreux progrès. Le recrutement d'un CDD à Cadarache fait, nous démarrons les analyses des propriétés chimiques des calcyanines.
- Pour la génétique, la construction de mutants de déletion est en cours. Plusieurs mutants par ailleurs restent à caractériser phénotypiquement.
- Une fois ces différents chantiers avancés nous nous attaquerons à la recherche d'autres protéines potentiellement impliquées dans la formationd e CaCO3 intracellulaire.

Nous avons à ce jour publié un article de revue sur les mécanismes moléculaires de la biominéralisation de CaCO3 par les bactéries. Et un article démontrant la possibilité de modifier génétiquement une souche de cyanobactérie formant des CaCO3 intracellulaire.
D'autres publications sont en cours de soumission et d'écriture sur la diversité des calcyanines au sein des cyanobactéries ainsi que la mesure de la concentration du calcium à nanoéchelle dans des bactéries par STXM.
Une partie de notre travail a aussi été présenté au cours d'une conférence keynote à la conférence internationale Goldschmidt.

1. Sigrid Görgen, Karim Benzerara, Fériel Skouri-Panet, Muriel Gugger, Franck Chauvat, Corinne Cassier-Chauvat (2021) The diversity of molecular mechanisms of carbonate biomineralization by bacteria. Discover Materials 1:2.
2. Chenebault C, Diaz-Santos E, Kammerscheit X, Görgen S, Ilioaia C, Streckaite S, Gall A, Robert B, Marcon E, Buisson DA, Benzerara K, Sassi JF, Cassier-Chauvat C, Chauvat F. A (2020) Genetic Toolbox for the New Model Cyanobacterium Cyanothece PCC 7425: A Case Study for the Photosynthetic Production of Limonene. Front Microbiol. 11:586601.
1. Keynote, Goldschmidt Conference. “Biomineralization of intracelllar amorphous calcium carbonates (ACC) by bacteria: molecular mechanisms, evolutionary history and environmental significance” Benzerara K, Bitard-Feildel T, Bolzoni R, Cassier-Chauvat C, Chauvat F, Dezi M, Duprat Elodie, Görgen S, Lefevre C, Lopez-Garcia P, Menguy M, Monteil C, Moreira David, Skouri-Panet F, Callebaut I.

Les cyanobactéries sont des organismes photosynthétiques diversifiés et très abondants qui utilisent la lumière pour fixer le CO2 atmosphérique et produire une biomasse considérable qui alimente une grande partie de la chaine alimentaire. Nous avons découvert récemment que certaines cyanobactéries forment des carbonates de calcium amorphes intracellulaires (iACC) et accumulent ainsi de très grandes quantités d’alcalino-terreux (AEEs) comme le Ca, Sr, Ba ou le Ra. Bien que cette accumulation massive intracellulaire interroge sur l’homéostasie particulière des AEEs par ces bactéries et offre des perspectives prometteuses pour remédier les pollutions radioactives en 90Sr et 226Ra, nous en ignorons les mécanismes. Grâce à une approche récente de génomique comparative, nous avons identifié un gène orphelin, nommé ccyA, vraisemblablement impliqué puisqu’il est présent chez toutes les cyanobactéries formant des iACC et absent des autres. Les prédictions bioinformatiques suggèrent que ccyA code une protéine nommée Calcyanine qui contient deux domaines protéiques présentant des similitudes mais aussi des différences claires avec d’autres domaines connus. Le projet Harley vise à déterminer les mécanismes biochimiques de l’accumulation intracellulaire et de l’homéostasie des AEEs chez les cyanobactéries formant des iACC et à comprendre le rôle de la Calcyanine. Il sera mené par un consortium interdisciplinaire regroupant des expertises en biochimie, biologie structurale, biophysique, biogéochimie, génétique et physiologie des cyanobactéries. Nous proposons de (1) caractériser les propriétés structurales et chimiques de la Calcyanine in vitro. La protéine et ses domaines séparés seront purifiés après expression en système hétérologue. Leurs structures seront déterminées par cristallographie des rayons X et cryo-microscopie électronique en transmission (MET). Leurs affinités pour le Ca, le Sr et le Ba seront mesurées et leur impact sur la précipitation des ACC sera analysé. (2) Caractériser la fonction de la Calcyanine in vivo. Nous éliminerons/complémenterons ccyA dans des souches formant des iACC et analyserons en détail le phénotype de toutes ces souches. Parallèlement, nous introduirons ccyA dans des souches modèles pour la génétique et ne formant pas d’iACC. La localisation de la Calcyanine sera déterminée par construction de fusions avec la protéine fluorescente GFP. Les phénotypes des mutants ainsi produits et notamment l’homéostasie des AEEs, seront analysés par des mesures de chimie des solutions, des analyses en MET et microscopie des rayons X à balayage en transmission. De plus, le Ca2+ libre sera mesuré par microscopie confocale à balayage laser dans des souches où nous aurons introduits des gènes rapporteurs du Ca. (3) Rechercher d’autres protéines impliquées dans la formation d’iACC par 3 approches : (i) mutagenèse aléatoire à l’aide de transposons, en discriminant les mutants d’intérêt par la diminution de leur densité cellulaire ; (ii) extraction et identification par spectrométrie de masse des protéines associées aux iACC; (iii) identification de protéines partenaires de la Calcyanine par co-immunoprécipitation. L’annotation structurale et fonctionnelle de ces protéines sera systématiquement entreprise par bioinformatique. En plus de faire progresser les connaissances sur l’homéostasie des AEEs dans ces cyanobactéries et des mécanismes de biominéralisation des iACC, les résultats du projet Harley seront de grand intérêt pour la biologie structurale du fait de la détermination de nouveaux repliements protéiques et de leur fonction ainsi que pour la microbiologie par le développement de nouveaux modèles génétiques manipulables dans les cyanobactéries. A plus long terme, le projet Harley sera aussi crucial pour le développement de nouveaux systèmes biomimétiques ou biosynthétiques pour une bioremédiation efficace de pollutions par les AEEs notamment radioactifs.