CE35 - Santé-Environnement : Environnement, agents pathogènes et maladies infectieuses émergentes et ré-émergentes, adaptations et résistance aux antimicrobiens.

Mutateurs transitoires et évolution de la résistance aux antibiotiques – TRANSMUTATOR

Pour surmonter les limitations des méthodes traditionnelles dans le domaine de la mutagénèse, telles que le test de fluctuation ou l'expérience d'accumulation de mutations, nous avons récemment développé une nouvelle approche pour étudier la mutagénèse à l'échelle des cellules individuelles. Cette méthode est basée sur la microfluidique, l'imagerie en temps réel et un marquage fluorescent du systeme de réparation des mésappariements (MMR) chez Escherichia coli, qui permet de détecter les mutations crées par erreur de réplication en temps réel, dans des cellules individuelles. Nous utiliserons cette méthode pour caractériser la dynamique de ces mutations en présence de concentrations sub-inhibitrices d'antibiotique.
Pour étudier l'influence des fluctuations de taux de mutation sur l'evolution de la résistance aux antibiotiques, nous contrôlerons le taux de mutation d'E. coli de façon dynamique et nous suivrons la fitness pendant l'adaptation aux antibiotiques, avec un taux de mutations constant ou fluctuant. Nous suivrons la fitness à l'échelle de la population grâce à des méthodes classique d'évolution expérimentale et à l'échelle des cellules uniques, en développant des expériences innovantes basées sur la microfluidique

Sur ce début de projet nous avons amélioré notre méthode de visualisation de mutations, sur deux points principaux : la qualité du signal de fluorescence, grâce à une réduction du photoblanchiment, et une amélioration de l'analyse d'images par des méthodes de deep learning.

Ce projet fournira une estimation quantitative des effets des antibiotiques sur la mutagénèse. De plus, il ouvre la voie à une étude approfondie de la théorie de la mutagénèse induite par le stress, à l'échelle des cellules uniques et de façon quantitative.
Nous améliorerons et étendrons notre approche cellules-uniques pour étudier les mutations. Nous développerons le premier outil optogénétique permettant de contrôler le taux de mutation temporellement et spatialement (i.e. dans une sous-population de cellules). Cet outil pourra par la suite être utilisé en microfluidique ou en culture liquide classique et sera donc un outil utile en évolution expérimentale (EE). Nous développerons également une approche cellules-uniques en évolution expérimentale, basée sur l'utilisation de microfluidique et vidéo-microscopie (mEE:microfluidic Experimental Evolution) . Les expériences de mEE permettront de suivre la fitness pendant l'évolution adaptative à l'échelle des cellules individuelles, à haut débit. Elles permettront de contrôler précisément l'équilibre entre sélection naturelle et dérive génétique, en contrôlant la taille de la population dans les chambres microfluidiques. De plus, au contraire des expériences d'évolution expérimentales classiques, les expériences mEE permettront un contrôle précis et dynamique des conditions environnementales, et une taille de population contrôlée et constante. Cette stabilité démographique permettra de faciliter l'analyse et les prédictions théoriques.
Nous visons donc à créer un système intégré pour étudier l'évolution et l'adaptation à 'léchelle des cellules uniques, où les conditions environnementale, la force de sélection et l'incidence des mutations peuvent être finement controlés.

à suivre...

Résumé de soumission

Les populations bactériennes contiennent souvent des mutateurs constitutifs, i.e. des mutants ayant un taux de mutation élevé et pouvant ainsi accélérer l’adaptation et promouvoir l’émergence de résistance aux antibiotiques. De plus, la stochasticité des réactions biochimiques intracellulaires peut créer des mutateurs transitoires, pouvant aussi faciliter l’adaptation. A l’inverse des mutateurs constitutifs, ces mutateurs transitoires n’ont pas été beaucoup étudié, par manque d’outils appropriés.
A cause de leur usage intensif en agriculture ainsi qu’en médecine vétérinaire et humaine, les antibiotiques sont souvent présents dans notre environnement à des concentrations sub-inhibitrices. Il a été montré que de telles concentrations d’antibiotiques sont susceptibles de promouvoir l’acquisition de résistance à de nombreux antibiotiques en augmentant le taux de mutations des bactéries. Cette augmentation du taux de mutations pourrait affecter toutes les bactéries ou au contraire pourrait être due à une sous-population de mutateurs transitoires, mais cela n’est pas connu. La présence de mutateurs transitoires pourrait avoir un impact important sur l’évolution de la résistance aux antibiotiques. Ceux-ci pourraient en effet accélérer l’adaptation sans payer le coût associé à un taux de mutation constamment élevé, qui mène à l’accumulation de nombreuses mutations délétères. L’évolution de phénotypes complexes tels que la résistance aux antibiotiques peut impliquer plusieurs mutations, dont les effets ne sont pas nécessairement indépendants. Ces mutations peuvent par exemple être délétères seules mais bénéfiques lorsqu’elles sont combinées. Cela suggère qu’une situation où le taux de mutation est constant et où les mutations sont acquises une par une et une situation où le taux de mutation fluctue beaucoup et où plusieurs mutations peuvent être acquises en même temps pourraient aboutir à des trajectoires évolutives différentes en présence de sélection. Les mutateurs transitoires pourraient donc faciliter l’acquisition de combinaisons de mutations, une étape critique à la fois dans l’émergence et dans le déclin de la résistance aux antibiotiques.
Jusqu’à récemment il n’existait pas d’outils adaptés à l’étude des mutateurs transitoires, ou autrement dit à l’étude des fluctuations de taux de mutations. Nous avons récemment développé de tels outils, permettant de suivre l’apparition de mutations en temps réel dans des cellules uniques d’Escherichia coli en croissance. Notre approche combine microfluidique, vidéo-microscopie et un marquage fluorescent du système de réparation des mésappariements. Le but de ce projet est d’utiliser cette nouvelle approche pour comprendre les origines et les conséquences évolutives des fluctuations de taux de mutations chez les bactéries. Plus précisément, nos objectifs principaux sont: 1) estimer les fluctuations du taux de mutation en présence de concentrations sub-inhibitrices de différents antibiotique, et 2) étudier l’influence de telles fluctuations sur l’évolution de la résistance aux antibiotiques.

Coordination du projet

lydia ROBERT (Microbiologie de l'alimentation au service de la santé)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

MICALIS Microbiologie de l'alimentation au service de la santé
LJP Laboratoire Jean PERRIN

Aide de l'ANR 362 879 euros
Début et durée du projet scientifique : septembre 2019 - 48 Mois

Liens utiles

Explorez notre base de projets financés

 

 

L’ANR met à disposition ses jeux de données sur les projets, cliquez ici pour en savoir plus.

Inscrivez-vous à notre newsletter
pour recevoir nos actualités
S'inscrire à notre newsletter