Suppression de la virulence et de la résistance aux antibiotiques de pathogènes Gram-positifs par l’utilisation de peptides lasso naturels et optimisés – lasSoCocci

Nous avons utilisé plusieurs approches de microbiologie pour caractériser les effets des peptides naturels et variants sur les entérocoques et staphylocoques : suivi de croissance bactérienne, détermination de la Concentration Minimale Inhibitrice de différents antibiotiques seuls et en association avec les peptides, tests de formation de biofilm.

Nous avons choisi le modèle animal insecte Galleria mellonella pour étudier l’effet anti-virulence des peptides et montrer que leur association avec la vancomycine permettait de traiter une infection à bactéries résistantes. Ce modèle est intéressant car les chenilles peuvent être maintenues à 37°C, ce qui mime la température du corps humain, leur système immunitaire est similaire au système immunitaire inné des mammifères et elles peuvent être facilement élevées.

La génération de mutants spontanés résistants aux effets des peptides couplée au séquençage global de leur génome nous a permis de trouver la cible moléculaire des peptides : les histidines kinases.

Nous avons analysé les gènes régulés par les différentes histidines kinases par RT-qPCR. Nous avons également analysé les muropeptides modifiés suite à l’activité des produits de ces gènes.

Nous avons utilisé plusieurs approches de génétique pour compléter la caractérisation de l’activité des peptides. Pour cela, de nombreuses souches bactériennes modifiées ont été construites par biologie moléculaire (PCR, clonages, construction de mutants par double crossing over).

Nous avons utilisé plusieurs approches de biochimie pour caractériser l’activité des peptides sur les histidines kinases : production hétérologue et purification de protéines, test d’interaction par Differential Scanning Fluorimetry, tests d’inhibition d’activité ATPase.

Enfin, des peptides variants ont été produits de manière hétérologue chez différentes souches de Streptomycès, ce qui fait appel à des approches de génétique propres à cet organisme. Les peptides naturels et variants ont été purifiés par chromatographie et caractérisés en spectrométrie de masse.

Un résultat extrêmement important obtenu dans ce projet est l’identification des Histidines Kinases (HKs) en tant que cibles des peptides lasso de type I sviceucine et siamycine (T1LPs).

Étant donné que les HKs contrôlent un large éventail de comportements bactériens, notamment la virulence, la formation de biofilm et la résistance aux antibiotiques, et que certaines HK sont essentielles et absentes dans les cellules de mammifères, elles représentent une cible médicamenteuse attrayante. Malgré des efforts considérables déployés pour identifier des inhibiteurs d’HKs, aucun d'entre eux ne fait actuellement l'objet d'essais cliniques. Notre découverte place donc les T1LPs comme candidats très prometteurs pour le développement d’antibitiotiques non conventionnels inhibants les HKs.

Nous avons par la suite caractérisé la totalité de la cascade de régulation affectée suite à l’inhibition des HKs, à la fois dans le cas de l’inhibition de la virulence et de celle de la résistance à la vancomycine (de type VanA et VanB), ce qui permet d’avoir une vision très complète des effets des peptides.

Un second résultat important est la démonstration en modèle animal que les T1LPs sont non toxiques et actifs pour traiter une infection à bactéries résistantes. Un premier brevet protégeant ces activités a été déposé.

Un troisième volet de résultats d’importance a été obtenu lors de la génération de peptides variants. En utilisant la sviceucine comme peptide modèle, nous avons généré des variants présentant des substitutions d’acides aminés. Ces variants ont présenté des activités modifiées et l’un d’entre eux, que nous appellerons « variant 1 » possède plusieurs caractéristiques d’intérêt :

1 : Comme à la sviceucine mais contrairement à la siamycine, le variant 1 n'inhibe pas la croissance bactérienne, ce qui est un atout car on peut s'attendre à ce que les effets possibles sur le microbiote soient moindres.

2 : il inhibe la virulence et la résistance à la vancomycine de type VanB.

3. il inhibe également la résistance à la vancomycine de type VanA, ce que la sviceucine ne fait qu'avec une efficacité limitée.

Nous avons ainsi obtenu la preuve de concept que les T1LPs peuvent être modifiés et, plus intéressant encore, adaptés pour cibler des HKs qui ne sont pas efficacement ciblées par le peptide naturel.

Le projet LasSoCocci a permis d'identifier les des peptides lasso de type I sviceucine et siamycine (T1LPs) comme des molécules appartenant à la catégorie très recherchée des inhibiteurs d’Histidines Kinases (HKs). En effet, étant donné que les HKs contrôlent un large éventail de comportements bactériens, notamment la virulence, la formation de biofilm et la résistance aux antibiotiques, et que certaines HK sont essentielles et absentes dans les cellules de mammifères, elles représentent une cible médicamenteuse attrayante.

Nous avons montré que les T1LPs pouvaient être utilisées en combinaison avec la vancomycine pour traiter une infection à bactéries résistantes. Nous avons découvert que de subtiles variations dans le domaine catalytique des HKs expliquent la sélectivité des T1LPs. Cela devrait permettre d'optimiser le ciblage d'un HK spécifique. Les T1LPs appartiennent à la famille des peptides synthétisés par voie ribosomale et modifiés après traduction (RiPPs) et sont donc accessibles à la modification par génie génétique. Nous avons obtenu la preuve de concept que nous pouvons générer des variants de T1LPs avec des propriétés améliorées, incluant le variant 1, qui bloque plus efficacement la résistance à la vancomycine de type VanA que la sviceucine. Nos résultats ont donc mis en évidence l’atout que représente la structure des T1LPs pour générer des inhibiteurs d’HKs sur mesure et donc de futurs antibiotiques non conventionnels, pouvant cibler la virulence, la formation de biofilm et la résistance aux antibiotiques des bactéries pathogènes.

Pour atteindre but, plusieurs objectifs restent à atteindre :

1) Déterminer de manière exhaustive quelles HKs des principaux pathogènes Gram+ (Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium et S. aureus) sont directement ciblées et inhibées par les T1LPs.

2) Caractériser au niveau structural l'interaction T1LPs - HKs.

3) Mener des études de relation structure-activité avec des T1LPs rationnellement modifiés et tester leurs activités et interactions avec les HKs.

4) Générer des peptides variants par mutagénèse aléatoire pour identifier ceux (i) ayant une meilleure affinité ou (ii) ciblant des HK non ciblés par les peptides naturels.

Le projet PIHKpath récemment accepté (ANR-24-CE18-2858) bénéficiera des découvertes réalisées lors du projet LasSoCocci pour atteindre ces objectifs en utilisant une approche multidisciplinaire combinant la microbiologie, la biologie structurale, la biochimie, la biologie chimique et la biologie moléculaire. Pour cela, le consortium LasSoCocci (CBSA et MCAM) a été rejoint par un partenaire possédant une expertise en biologie structurale (CiTCom).

Projet LASSOlution, en phase de maturation auprès de la SATT Lutech (références MA00354 – DFM – CI20180619). Inventeurs : Li Y, Giraud C, Boudrioua A, Hartke A.

Le nombre d’infections causées par des bactéries multi-résistantes aux antibiotiques est en augmentation alarmante dans le monde. Enterococcus faecalis, E. faecium et Staphylococcus aureus sont les principales bactéries pathogènes à Gram positif provoquant de graves infections nosocomiales. Ces bactéries ont développé une résistance à la vancomycine, un antibiotique de dernier recours, et leurs infections sont aujourd'hui difficiles à traiter. Il y a donc un besoin urgent de nouveaux antibiotiques, tout spécialement pour E. faecium et S. aureus résistants à la vancomycine, qui ont récemment été classés hautement prioritaires par l’Organisation Mondiale de la Santé. Des composés intéressants seraient des molécules ciblant d’importants facteurs de virulence ou les mécanismes de résistance des bactéries. Nous avons identifié la svicéucine et la siamycine, des peptides lasso prometteurs pour lutter contre les pathogènes résistants. Nous avons montré que ces peptides sont capables de supprimer complètement la virulence d’entérocoques et la résistance à la vancomycine d’entérocoques et de S. aureus sans montrer d’effets toxiques pour les animaux. A notre connaissance, il s’agit du premier exemple de molécules supprimant à la fois la virulence et la résistance aux antibiotiques. Il est donc important de comprendre leur mode d’action qui semble différent des antibiotiques conventionnels. Ceci est essentiel pour leur potentiel développement comme antibiotiques de nouvelle génération et permettra la découverte de nouvelles voies pouvant être ciblées par des thérapies antimicrobiennes. Ce projet vise donc à comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents et à étudier les relations structure-fonction de ces peptides. Pour atteindre ces objectifs, nous allons utiliser plusieurs techniques interdisciplinaires et complémentaires.
En nous basant sur les données de la littérature et sur nos résultats préliminaires nous formons l'hypothèse que la svicéucine et la siamycine ciblent directement certaines protéines, à savoir les histidines kinases de systèmes à deux composants. Nous supposons que l'interaction avec certaines de ces cibles pourrait déclencher des changements importants dans l'expression génétique, potentiellement à la base de la diminution observée de la virulence. Par conséquent, nous effectuerons une analyse globale du transcriptome par séquençage d'ARN en présence ou en absence des peptides lasso. Pour élucider le mécanisme permettant la suppression de la résistance à la vancomycine par les peptides lasso, l'une des stratégies sera d’isoler des mutants spontanés résistants à cet effet des peptides, qui seront analysés par séquençage du génome. Cette approche est largement utilisée pour l'identification des cibles de molécules antibactériennes. En outre, les protéines suspectées d'être directement visées par les peptides lasso seront purifiées et leurs interactions avec les peptides seront examinées. L'identification des cibles directes des peptides sera complétée par des approches de pull-down / immuno-précipitation qui sont également complémentaires des approches globales mentionnées plus haut pour déchiffrer les mécanismes moléculaires impliqués dans les effets de la svicéucine et de la siamycine. Les protéines identifiées comme cibles potentielles des peptides seront étudiées plus en détail en utilisant des approches in vivo et in vitro.
Sur la base des informations obtenues, nous allons ainsi concevoir rationnellement de nouveaux peptides ayant des propriétés modulées et examiner leurs effets sur les trois bactéries pathogènes utilisées dans cette étude. La découverte du potentiel des dérivés de la svicéucine et de la siamycine pour lutter contre les infections à bactéries multi-résistantes et leur optimisation, dans un contexte où la découverte de nouveaux antibiotiques est extrêmement rare, fourniront une alternative aux traitements existants contre les agents pathogènes à Gram positif multi-résistants.