Validation et decouverte de cibles d'immunotherapie dans les cellules dendritique et cellules myeloides par sequençage ARN en cellules uniques et edition du génome – DC-Target

Pour identifier les cibles thérapeutiques potentielles sur les DCs dans le contexte tumoral, nous avons couplé des stratégies de tri cellulaire très fines, différentes approches omiques et des analyses spatiales.

Les DC sont en effet des cellules très rares (<0.5% des cellules d’une tumeur ou du sang) et nécessitent donc d’être enrichies afin d’obtenir un signal suffisant lors d’analyses d’expression des gènes.

Pour ce faire, nous avons testé différents protocoles sur plusieurs machines de tri cellulaire puis mis au point une stratégie de tri multiparamétrique. La solution de tri retenue a été un cytomètre en flux disponible sur la plateforme du Centre de recherche en cancérologie qui permet à la fois l’utilisation de nombreux marqueurs pour identifier les populations d’intérêt et offre une bonne rapidité de tri essentielle pour préserver la qualité des ARN messagers et le succès de l’analyse transcriptomique.

Pour l’analyse transcriptomique profonde en (bulk) RNA-seq, nous avons trié les 3 principales sous-populations de DC séparément à partir d’échantillons de tumeur du sein de patientes et de sang de donneurs sains. Nous avons ensuite réalisé le protocole SMART-Seq v4 (Takara®) suivi d’un séquençage avec 32 millions de reads par échantillon.

En parallèle, nous avons réalisé une analyse transcriptomique plus fine, en cellule unique (scRNA-seq), sur des échantillons de tumeur de sein, d’ovaire et de colon. Pour cela, nous avons trié séquentiellement chaque cellule dans une plaque 384 puits et fait réaliser un protocole de scRNA-seq (CEL-seq2). Cette stratégie de tri nous a permis d’associer l’expression génique avec le phénotype des cellules détectées sur le cytomètre en flux. Cela offre un atout essentiel pour l’identification fine des cellules.

Ces deux jeux de données complémentaires originaux nous ont permis d’allier une très bonne sensibilité d’analyse (RNA-seq) mais également de résoudre l’hétérogénéité de ces populations rares (scRNA-seq).

Ces données ont été enrichies grâce à des bases de données publiques, qui apportent plusieurs informations telles que l’expression des gènes détectés dans les tissus sains, la localisation sub-cellulaire des protéines codées, la spécificité d’expression des gènes dans un cancer particulier ou non.

Nous avons ainsi généré une base de données qui permet d’identifier des gènes (et des voies moléculaires correspondantes) spécifiques de i) chaque sous-population de DCs infiltrant la tumeur, ii) du tissu tumoral par rapport au sang ou au tissu sain, iii) qui codent pour des protéines localisées à la membrane ou non, iv) et associés à une fonction biologique d’intérêt pour la réponse antitumorale.

Également, nous avons exploré une approche de protéomique en cellule unique développée par Cellenion®.

Enfin, nous avons réalisé des analyses spatiales pour identifier une organisation particulière des DCs au sein des tumeurs et leurs proximités avec des cellules effectrices.

1. Les cellules dendritiques (DC) infiltrant la tumeur présentent des voies immunitaires activées par rapport à celles du sang.

Nous avons évalué par RNA-seq l'expression des gènes spécifiques aux sous-populations de DC associées aux tumeurs (TA-DC), tels que les DC conventionnelles de type 1 et 2 (cDC1, cDC2), DC plasmacytoïdes (pDC), par rapport aux DC du sang. Une analyse non supervisée a montré que les DC sont premièrement discriminées par leur tissu d’origine (tumeur versus sang), puis par leur lignage phénotypique (cDC1, cDC2, pDC). De plus, l'analyse a révélé 5756 gènes différentiellement exprimés (DEG) dans les TA-DCs comparativement aux DC du sang. À partir de ces DEG, nous avons ensuite effectué une analyse d'enrichissement des voies de signalisation pour évaluer les voies biologiques activées dans les TA-DC. Nous avons observé un enrichissement en voies moléculaires liées à la réponse inflammatoire. Ces voies peuvent refléter une intense réponse antitumorale en cours.

2. Les sous-populations de DC présentent à la fois des voies immunitaires communes et exclusives dans le microenvironnement tumoral.

Pour aller plus loin, nous avons évalué si cet état d'activation se produisait différemment dans chaque sous-population de DC. Les trois sous-populations de TA-DC partageaient un noyau commun de 380 DEG surexprimés et 194 sous-exprimés par rapport à leurs équivalents sanguins. Ainsi, nos résultats montrent que les sous-populations de DC sont activées dans la tumeur par rapport à celles du sang, avec à la fois des gènes et des voies biologiques exprimés en commun et de manière exclusive.

Ces résultats ont été couplés à des données publiques indiquant les protéines codées par ces gènes avec leur localisation, leur fonction, leur expression dans des tissus sains ou tumoraux. Nous exploitons actuellement cette base de données et confirmons l’intérêt de certaines protéines, ainsi que la faisabilité de les cibler thérapeutiquement.

3. Les cDC1 révèlent une hétérogénéité transcriptomique.

En parallèle, nous avons exploré l’hétérogénéité des TA-DC par une approche scRNA-seq. Nos résultats montrent des clusters au sein des cDC1 et cDC2 avec des états d’activation bien spécifiques, et certains DEG ou voies moléculaires déjà détectés en RNA-seq.

Nous avons également pu démontrer la présence de cDC1 avec un profil singulier dès les stades précoces d’apparition du cancer dans un modèle murin.

4. Les sous-populations de cDC1 sont visibles in situ.

Nous avons également identifié in situ par microscopie une population particulière de TA-cDC1 dans différents types de cancer. Nos investigations actuelles cherchent à démontrer l’origine et le rôle fonctionnel de ces cellules.

5. CLEC-1 : cible thérapeutique potentielle

OSE Immunotherapeutics a évalué le rôle et le potentiel thérapeutique de CLEC-1, chez la souris (Drouin et al., Sciences Advances, 2022). Des développements approfondis sont en cours sur cette cible ainsi que sur d'autres cibles d'intérêt.

Dans l'ensemble, notre étude a apporté de nouvelles informations sur 1) l'hétérogénéité des sous-populations de DC et leur organisation spatiale dans le microenvironnement tumoral, 2) ainsi qu’une base de données informative de cibles potentielles sur les DC dans les tumeurs solides.

1) Nos analyses fines par transcriptomique et par microscopie ont permis d’identifier un état des DC qui pourraient impacter la réponse antitumorale. Nous investiguons actuellement la fonction de cette population et sa distribution spatiale au sein des tumeurs, vis-à-vis des autres cellules immunitaires mais également des îlots tumoraux.

2) Compte tenu de leur rôle central dans l'immunité antitumorale, les DC sont une cible thérapeutique de choix. Ici, nous avons combiné plusieurs approches de transcriptomique ainsi que des informations déjà publiées pour proposer une base de données indiquant pour chaque gène d’intérêt, son expression par sous-population de DC, sa présence dans les tissus sains ou tumoraux ou encore sa fonction moléculaire connue. Actuellement, nous vérifions les gènes d'intérêt sélectionnés et effectuons une validation croisée approfondie avec d’autres jeux de données de transcriptomique en cellule unique (scRNA-seq) dans plusieurs cancers. L’objectif est de conserver uniquement les gènes spécifiques d’une sous-population de DC et qui ne sont pas ou peu exprimés au niveau ARN dans tout autre type cellulaire. Ceci afin d’obtenir une liste de gènes à cibler qui ont le moins de risque de créer des effets indésirables sur d'autres cellules. De plus, en utilisant des jeux de données publiques de scRNA-seq des lymphocytes T, nous évaluons si les cibles sélectionnées sur une sous-population de DC sont susceptibles d'interagir avec des récepteurs/ligands sur les lymphocytes T. En parallèle, ces gènes sont comparés aux bases de données de pronostic cliniques (interne ou publique) pour révéler toute association avec un impact clinique positif (ou une résistance aux traitements qui pourrait être surmontée). Enfin, l'expression des gènes pertinents sera validée au niveau protéique in situ par le panel d'immunofluorescence multiplexée et le pipeline bio-informatique que nous avons mis en place. Nous espérons identifier rapidement des cibles clés et commencer l'évaluation de leur fonction biologique in vitro et in vivo, ainsi que le développement d'anticorps contre ces cibles en partenariat avec OSE immunotherapeutics. Enfin, il est à noter que plusieurs gènes présentent une expression diminuée au sein de la tumeur. Pour ces gènes inhibés dans la tumeur et qui ont une fonction susceptible de participer à la réponse antitumorale, la stratégie thérapeutique nécessiterait un ciblage indirect par un agoniste d’un récepteur en amont de l’expression du dit gène.

De nouvelles stratégies thérapeutiques sont nécessaires pour le traitement des cancers du sein triple négatif (TNBC) puisque leur médiane de survie sans récidive est de 2,6 ans et le risque de décès de près de 100% lors de la rechute. Les approches d'immunothérapie (IT) sont en cours d'investigation dans les TNBC, y compris au Centre Léon Bérard. Alors que de multiples évidences à la fois chez la souris et chez l’homme illustrent le rôle central des cellules dendritiques (DC) et des cellules myéloïdes dans la régulation de l’immunité anti-tumorale, la majeure partie des IT actuellement en clinique ciblent les cellules T et les approches scRNAseq actuelles de l’environnement tumoral analysant les cellules immunitaires CD45+ ont principalement exploré l’hétérogénéité des cellules T en laissant de côté les populations de cellules rares de l’immunité innée. Nos données montrent que, dans les tumeurs mammaires invasives, les cDC1 (nécessaires à la réponse cytotoxique CD8) et la voie de l’interféron de type-III (IFN-III) montrent un impact positif sur la survie des patientes à l’inverse des macrophages immunosuppresseurs. De plus, nos données sur les tumeurs mammaires précoces suggèrent qu’une réponse immunitaire innée impliquant l’activation des DC et de la voie des IFN conduit à une immunité anti-tumorale adaptative protectrice qui est dominée par les cellules myéloïdes suppressives dans les tumeurs invasives.
Trois objectifs clés (KO) seront poursuivis sur 4 ans dans ce projet DC-TARGET:
• KO1 : Caractériser en profondeur par RNAseq sur cellule unique (scRNAseq), les DC, Macrophages et autres sous-types de cellules myéloïdes infiltrant la tumeur, en utilisant la technologie innovante de Cellenion ;
• KO2 : Valider des cibles préalablement identifiées et découvrir de nouvelles voies opérant dans des types cellulaires uniques et rares de l’immunité innée l'aide d’outils de bio-informatique perfectionnés et de biologie des systèmes;
• KO3 : Identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour développer de nouveaux candidats médicaments afin de réactiver l'immunité anti-tumorale dans les tumeurs avancées, chez les patientes résistantes aux inhibiteurs de points de contrôles immunitaires (ICP) des cellules T.

Ces objectifs pourront être atteints grâce à l'expertise conjointe des équipes de :
i) C Caux, pionnier dans le domaine de la biologie des sous-populations de DC et de l'évasion immunitaire dans les tumeurs du sein et ayant l’expérience de partenariat pour le développement de médicaments contre des cibles identifiées ;
ii) Cellenion (sous-traitant) qui développe une technologie de pointe pour la distribution en cellules uniques de cellules rares permettant la réalisation de nano-librairies et de scRNAseq à faible coût, pour un niveau d’information jamais atteint à ce jour pour de telles cellules ;
iii) la plateforme de bioinformatique Gilles Thomas(PGT), dotée d’une expertise reconnue en matière de biologie des systèmes et bioinformatique avancées pour l'analyse des scRNAseq et multi-omiques et l'identification de voies spécifiques ; et
iv) OSE Immunotherapeutics (OSE), une société de biotechnologie de stade clinique impliquée en immuno-oncologie par la mise au point de médicaments (anticorps monoclonaux, AcM) ciblant le lymphocyte T, mais également le compartiment cellulaire myéloïde.

En comparant le tissu mammaire normal au cancer TNBC, ce programme devrait révéler des voies activées dans les DC qui sont contrebalancées par les cellules myéloïdes suppressives dans les tumeurs invasives, permettant ainsi de découvrir de nouvelles cibles qui seront poursuivies pour le développement d’AcM.

Globalement, ce programme devrait aboutir à la mise au point de 2 nouveaux AcM thérapeutiques ciblant les DC ou cellules myéloïdes, qui représentent des thérapeutiques innovantes directement évaluables dans le cadre d'essais cliniques sur des patientes atteintes de TNBC.