Vectorisation de complexes d'iridium(III) par les sidérophores : des chevaux de Troie contre les bactéries pathogènes Gram-négatives – VECTRIUM

Les conjugués attendus sont constitués d’un analogue de sidérophore et d’un PS organométallique reliés par un espaceur. Les chimistes du partenaire 1 concevront et synthétiseront les blocs sidérophore-espaceur. Dans ce projet, trois systèmes d’absorption du fer dépendants des sidérophores seront utilisés : ceux qui dépendent de la pyochéline (Pch), de la pyoverdine (Pvd), de l’entérobactine (Ent) et de la déféroxamine (Dfo). Le Dfo est un sidérophore disponible dans le commerce, déjà fonctionnalisé et donc prêt à être conjuguer avec le PS. La Pvd sera extraite et purifiée à partir de cultures de Pseudomonas et utilisée pour produire des conjugués hémisynthétiques avec des PS organométalliques. Enfin, le partenaire 1 a décrit précédemment la synthèse d’analogues de la Pch et de l’Ent capables de favoriser l’accumulation de fer dans les bactéries et de vectoriser des xénobiotiques dans P. aeruginosa. Ainsi, les vecteurs nécessaires au projet sont facilement accessibles en adaptant les protocoles rapportés par le partenaire 1. La réaction CuAAC (chimie click) sera principalement utilisé pour conjuguer les vecteurs et le PS organométallique.
Les PS organométalliques seront synthétisés par le Partenaire 2. Dans une première approche, des PS activables avec la lumière bleue seront connectés au vecteur sidérophore. Cependant, la lumière bleue pourrait être délétère pour les cellules de l’hôte eucaryote aussi le développement de PS pouvant être activés dans le rouge serait un atout pour le projet. À cette fin, des ligands seront sélectionnés pour générer des complexes métalliques présentant une absorption maximale autour de 550-600 nm.
Les conjugués seront ensuite évalués pour leurs propriétés photophysiques et électrochimiques et seront soumis à la spectroscopie UV-visible et à la voltampérométrie cyclique pour déterminer la longueur d’onde d’absorption et, par conséquent, la source lumineuse d’excitation et le potentiel redox à l’état fondamental. La caractérisation photophysique complète des conjugués inclura également la mesure de la durée de vie de l’état excité car ce paramètre est une donnée essentielle pour l’optimisation de l’activité du PS. Enfin, comme certains PS peuvent être photo-instables, la robustesse de nos composés sous irradiation sera également évaluée dans des mélanges solvant/eau et des milieux de culture.
L’activité antibactérienne (CMIs) des conjugués chevaux de Troie sera évaluée par le partenaire 3 sur un panel de bactéries pathogènes en présence/absence de lumière par la méthode de microdilution. Une comparaison des CMIs obtenus dans des milieux riches et appauvris en fer fournira des renseignements sur l’implication des systèmes d’absorption du fer. Dans ces expériences, les conjugués seront comparés à des antibiotiques approuvés utilisés comme référence. La capacité des conjugués à favoriser l’acquisition de fer sera confirmée à l’aide de tests d’absorption de 55Fe par le partenaire 1.

Les conjugués cibles de notre projet sont constitués de trois éléments : le sidérophore vecteur, le complexe métallique reliés par un bras espaceur. Dans une première approche, et afin de valider nos hypothèses liées à la synthèse nous avons utilisé comme sidérophore, la deferoxamine (Dfo), sidérophore commercial, peu onéreux et surtout déjà fonctionnalisé. Nous avons ainsi obtenu les conjugués correspondants. Ces résultats ont permis de valider l’approche synthétique utilisée, notamment l’usage de la chimie click (CuAAC) et ont permis de lever certains verrous liés notamment à la purification finale des composés. En parallèle le partenaire 1, en collaboration avec une équipe de l’Université de Hambourg a obtenu la structure tridimensionnelle du transporteur FoxA de P. aeruginosa co-cristallisé avec un analogue de la DFO (Nocardamine). Ces résultats devraient permettre de mener des études SAR afin d’optimiser la structure de nos conjugués.
Les premiers conjugués dérivées de la Dfo ont été testées récemment pour leur activité antibactérienne intrinsèque, c’est à dire sans lumière, sur un panel de bactéries pathogènes. La majorité de ces molécules ont montré une activité sur les bactéries Gram-positives (jusqu’à 0,5 µg/ml), qui semble indépendante de la concentration en fer dans le milieu ce qui suggère une pénétration sidérophore-indépendante dans ces pathogènes. Ces molécules n’ont pas d’efficacité sur les bactéries Gram-négatives en l’absence de lumière et aux concentrations testées (= 64 µg/ml). Les semaines à venir devrait voir les premiers essais sous irradiation (lumière LED bleue), non seulement sur les conjugués de la DFO mais aussi sur ceux, plus prometteurs, fondés sur des sidérophores catécholés, actuellement en cours de synthèse. En effet, des analogues du sidérophore entérobactine (Ent) doivent être désormais conjugué avec le complexe métallique avant de pouvoir être testé, seuls ou en présence de lumière. Des travaux préliminaires ont été initiés dans le domaine de l’absorption dans le rouge des complexes organométallique par modification des ligands portés par le centre métallique. Plusieurs ligands de la littérature ont été choisis afin d’atteindre cet objectif. Certains complexes ont montré de faibles solubilités dans les solvants organiques usuels et d’autres ont conduit à la formation de sous-produits inséparables du complexe souhaité. Enfin, les ligands dérivés notamment de la coumarine ont permis d’obtenir des propriétés de solubilités acceptables, les études des propriétés photophysiques sont en cours et des modifications structurales sont envisagés afin de générer un effet bathochrome plus important sur la longueur d’onde maximale d’absorption des complexes.

A ce jour les conjugués dérivés de la Dfo ont été obtenus et ceux qui dérivent d’un analogue du sidérophore Ent sont en cours de synthèse. La purification de la Pvd et la synthèse d’un analogue de la Pch, sont en cours et devraient donc permettre d’obtenir les conjugués correspondants. Pch et Pvd sont les deux sidérophores endogènes de notre organisme modèle, P. aeruginosa, et devraient donc être les véritables juges de paix de notre stratégie à l’issu des tests d’activité antibactérienne en présence/absence du lumière. Si ces résultats confortent notre stratégie, nous souhaitons ensuite développer une chimiothèque de sidérophores présentant différentes combinaison de trois groupements chélateurs bidentates afin de satisfaire la coordination octaédrique hexadentate du Fe(III). Les conjugués avec des PS organométalliques correspondants seront ainsi synthétisés et évalués. Les conjugués les plus prometteurs seront ensuite étudiés afin de montrer d’éventuelles résistances et leurs mécanismes/origines. Cette donnée est essentielle pour développer des conjugués présentant une grande robustesse vis-à-vis de ce processus évolutif. Enfin pour les conjugués les plus intéressants, leurs toxicités seront évaluées sur des hépatocytes sains afin d’évaluer leur potentiel thérapeutique. En fonction des résultats obtenus à l’issue de ce processus, les promoteurs de ce projet soumettront les données à la SATT Conectus (Alsace) afin de postuler à un fond de maturation permettant d’évaluer le potentiel de notre approche in vivo.

Vincent Normant, Inokentijs Josts, Lauriane Kuhn, Quentin Perraud, Sarah Fritsch, Philippe Hammann, Gaëtan L. A. Mislin, Henning Tidow, and Isabelle J. Schalk (2020). Nocardamine-Dependent Iron Uptake in Pseudomonas aeruginosa: Exclusive Involvement of the FoxA Outer Membrane Transporter. ACS Chem. Biol. 15, 10, 2741-2751. doi.org/10.1021/acschembio.0c00535

Les bactéries pathogènes ont toujours été un péril pour l'humanité mais la découverte des antibiotiques a permis d'éradiquer les épidémies bactériennes de masse. Néanmoins, l'être humain est de plus en plus confronté à des infections résistantes aux antibiothérapies classiques. Le développement de nouvelles stratégies antibactériennes est donc primordial, en particulier contre les bactéries Gram-négatives dont les souches les plus résistantes conduisent à des impasses thérapeutiques. Les antibiotiques actuels sont majoritairement organiques et les molécules organométalliques semblent, elles, réservées au traitement de pathologies comme le cancer. Cependant, les profils de toxicité des antibiotiques de dernière ligne, utilisés à l’heure actuelle (colistine, polymyxines, oxazolidinones, etc.) font des composés organométalliques une alternative désormais crédible pour de nouvelles stratégies antibactériennes. Certains complexes métalliques ont, de plus, montrés qu’ils pouvaient servir de photosensibilisteurs (PS) utilisables dans des approches de thérapie photodynamique (PDT) antibactérienne. C’est particulièrement le cas des complexes d’iridium(III). La majorité de ces entités organométalliques sont néanmoins incapables de traverser l’enveloppe des bactéries Gram-négatives pour rejoindre leurs cibles intracellulaires. Les voies bactériennes d’assimilation du fer sont des « portes » dans l’enveloppe. Les sidérophores, molécules chélatrices de fer secrétées par les bactéries, utilisent ces voies pour transporter le fer au travers de l’enveloppe vers les compartiments internes de la bactérie. Les sidérophores peuvent donc servir de vecteurs pour introduire des PS à base d’iridium(III) dans les bactéries Gram-négatives par une stratégie de cheval de Troie. Dans notre approche les propriétés ferro-chélatrices des vecteurs sont conservées et un complexe stable d’iridium(III) est conjugué au sidérophore par l’intermédiaire d’un bras espaceur. La reconnaissance du sidérophore ferrique par les transporteurs membranaires bactériens entrainera l’import de l’ensemble du conjugué à l’intérieur de la bactérie. Cette stratégie devrait permettre, tout à la fois, d’améliorer la pénétration des PS organométalliques au travers des membranes bactériennes et en limitant la toxicité périphérique de ces composés pour l’hôte. Les vecteurs utilisés dans notre approche sont des analogues de l’entérobactine, du ferrichrome ou de la pyochéline, trois sidérophores utilisés par des pathogènes Gram-négatifs dits critiques (Liste OMS). Ces vecteurs seront synthétisés dans l’équipe du partenaire 1 (Dr. Gaëtan MISLIN, UMR7242, Illkirch) et seront ensuite conjugués à des complexes d’Ir(III) préparés par le partenaire 2 (Dr. Sylvain GAILLARD, ENSICaen, Caen). Les conjugués synthétisés seront ensuite testés sur Pseudomonas aeruginosa, une bactérie pathogène responsable d’infections graves, et réputée comme peu perméable aux xénobiotiques. Les tests d’activité antibiotique se dérouleront en présence, et en absence, de lumière sur des cultures planctoniques et sur du biofilm bactérien. Les composés les plus performants seront ensuite testés sur des fibroblastes pulmonaires humain infectés en culture, afin d’évaluer à la fois la cytotoxicité des conjugués et la robustesse de notre stratégie antibactérienne en présence de cellules eucaryotes. Enfin, la conception d’une approche thérapeutique pérenne doit intégrer une étude des mécanismes potentiellement impliqués dans l’émergence de la résistance. Dans ce but, le partenaire 3 (Pr Patrick PLESIAT, Besançon) déterminera les stratégies d’évitement mis en place par les bactéries résistantes à notre approche. En outre ce partenaire dépend aussi du Centre National de Référence sur les Résistances. Les molécules les plus prometteuses pourront donc être testées sur une grande variété d’espèces bactériennes (Gram positives et négatives) mais aussi des isolats cliniques résistants.