Neutralisation des sporozoïtes de Plasmodium dans la peau de l'hôte – SporoSTOP

Pour déterminer le rôle des tissus dans la protection, nous avons récemment développé une méthode qui permet de quantifier l'impact de la migration des sporozoïtes à travers la peau et de le comparer à l'infection initiée par l'injection intraveineuse de parasites (Aliprandini et al, Nat Microbiol 2018). Cette méthode permettra de déterminer le site d'action préférentiel des différents anticorps monoclonaux (AcM) à tester ainsi que leur efficacité protectrice relative. Les AcM sélectionnés seront utilisés pour être étudiés en détail par l’imagerie in vivo à l'aide de parasites exprimant la luciférase, la GFP et la GFP-CSP afin d'observer quantitativement la neutralisation des sporozoïtes en temps réel. In vitro, nous quantifions et développons des tests pour mesurer les activités neutralisantes potentielles médiées par ces AcM telles que l'inhibition de la motilité et de l'infection cellulaire, l'activité cytotoxique, la réaction de précipitation circumsporozoïte, pour les corréler avec la protection in vivo dans les tissus.
Enfin, d'autres protéines de surface candidates seront testées comme cibles potentielles d'anticorps neutralisants par vaccination passive et active.

Durant ces 18 premiers mois, nous nous sommes principalement concentrés sur les objectifs (1) et (2).
Nous avons montré que l'anticorps monoclonal (AcM) 3D11 qui cible la CSP de Plasmodium berghei agit également majoritairement sur les sporozoïtes lors du passage à travers la peau, comme précédemment montré pour P. yoelii. De plus, l'imagerie in vivo indique un effet neutralisant tardif de 3D11 suite à l'invasion du parenchyme hépatique. Cet effet tardif a été confirmé in vitro suite à l'invasion des cellules hôtes. La caractérisation détaillée de ce phénomène sera réalisée in vitro et in vivo à l'aide des sporozoïtes GFP-CSP dans la continuité du projet.
Nous avons également testé 14 AcM humains dirigés contre la CSP de P. falciparum. In vivo, tous les AcM humains protecteurs ciblaient principalement les sporozoïtes lors de leur passage à travers la peau de l'hôte. À la concentration testée, la majorité des AcM humains n'ont pas protégé de manière significative les souris lorsque les sporozoïtes ont été inoculés par voie intraveineuse, indiquant une faible activité neutralisante dans le sang/le foie. Malgré l'action de neutralisation prédominante dans la peau, trois d'entre eux ont également neutralisé de manière significative les sporozoïtes dans le sang/le foie comme le AcM 3D11. In vitro, ces 14 hmAbs ont été testés dans des essais d'inhibition de la motilité du parasite, d'activité cytotoxique, de formation de la réaction de précipitation de CSP (CSPR) et de liaison aux sporozoïtes, et chaque activité a été confrontée à l’activité protectrice in vivo. La cytotoxicité, l'inhibition de la motilité et la CSPR étaient corrélées à la protection après une infection par inoculation de sporozoïtes dans la peau. Par conséquent, avec ces résultats, nous avons confirmé le rôle crucial de la peau dans la protection médiée par les anticorps cytotoxiques ciblant la CSP.
L'imagerie in vivo de la peau de souris transférées avec des AcM humain protecteurs avec une faible activité neutralisante sur le sang, a montré une inhibition de l'invasion des vaisseaux sanguins des sporozoïtes comme prévu. Cependant, le niveau d'inhibition était bien inférieur au niveau de protection in vivo, indiquant que ces AcM humain protecteurs diminuaient la virulence du parasite lors de sa migration à travers la peau.
Nous concevons actuellement des expériences pour tester l'hypothèse selon laquelle les anticorps ciblant la CSP diminuent le « fitness » du parasite lorsque le sporozoïte se déplace en 3D. Ce test, une fois pleinement établi, pourrait être utilisé pour corréler l'activité neutralisante du sérum de volontaires vaccinés avec le RTS,S avec le statut protecteur tel que proposé dans l'objectif (4), et éventuellement, être utilisé pour optimiser les vaccins humains basés sur la PfCSP.
Enfin, l'identification d'anticorps potentialisant la neutralisation des anti-CSP dans la peau sera poursuivie dans les prochaines années.

Dans cette première période d'études, nous avons montré le rôle crucial et général de la peau dans la protection médiée par des anticorps cytotoxiques ciblant la CSP à l'aide de 14 anti-P. falciparum anticorps monoclonaux humains et un anticorps monoclonal contre la CSP de P.berghei. Nous avons également établi des corrélats de protection des AcM humains ciblant la Pf CSP. Nous avons également réussi à générer un parasite transgénique GFP-CSP P.berghei qui permettra d'imager en détail l'action des anticorps protecteurs dans la peau et le foie et d'étudier l'effet neutralisant des anticorps anti-CSP dans le développement intracellulaire du parasite.
Enfin, dans les années suivantes, nous nous concentrerons sur le développement d'un test in vitro pour quantifier la perte d'infectiosité du parasite en utilisant un environnement migratoire 3D pour corréler cette activité neutralisante avec une protection in vivo chez des volontaires vaccinés, ainsi que, sur le test de l'activité protectrice d'autres protéines candidates de surface.

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Les sporozoïtes de Plasmodium, agent causateur du paludisme, sont des formes très mobiles du parasite et sont inoculées par le moustique dans le derme de l'hôte mammifère. Essentielle pour accéder à la circulation sanguine, la motilité des sporozoïtes peut être inhibée par des anticorps dirigés contre la principale molécule de surface du parasite, la protéine circumsporozoïte (CSP). Récemment, le laboratoire du Dr. Amino a décrit un nouveau mécanisme par lequel ces anticorps tuent directement les sporozoïtes. Cette cytotoxicité dépend de deux activités indispensables à la progression du sporozoïte dans la peau de l’hôte : la motilité et la sécrétion d'une protéine semblable à la perforine. En conséquence, la protection in vivo dépend de l'inoculation des sporozoïtes dans la peau, par la piqûre du moustique ou par micro-injection. Le laboratoire du Dr. Frischknecht a développé un ensemble d'outils pour étudier la motilité des sporozoïtes, notamment le déploiement de pinces optiques et la mutagenèse subtile de protéines clés de la motilité. Récemment, une série de lignées de parasites exprimant la CSP fusionnée en différents endroits à la GFP a notamment été générée. Nous proposons ici de combiner notre expertise pour (i) tester la généralité du mécanisme de protection des anticorps cytotoxiques et sa dépendance de la phase cutanée en utilisant des sporozoïtes exprimant la CSP d’espèces plasmodiales infectieuses pour les rongeurs ou les humains; (ii) imager et caractériser quantitativement in vitro et in vivo la manière dont les anticorps protecteurs neutralisent les sporozoïtes à l'aide de parasites exprimant les protéines de fusion GFP-CSP; (iii) identifier des anticorps qui potentialisent la neutralisation induite par les anticorps anti-CSP dans la peau et (iv) développer un environnement 3D in vitro permettant de déterminer rapidement si les niveaux de protection chez les individus exposés naturellement aux moustiques ou vaccinés avec RTS,S/AS01 sont en corrélation avec l'activité cytotoxique ou l’inhibition de la motilité. Les résultats attendus nous aideront à mieux comprendre comment la CSP contribue à l'infectivité du sporozoïte, comment les anticorps peuvent neutraliser le parasite et comment améliorer l'efficacité de la vaccination basée sur la CSP, soit par la mise en évidence d'un corrélat immunitaire de protection et/ou par l’identification de nouveaux antigènes protecteurs ciblant les sporozoïtes cutanés.