Morphogenèse, organisation et fonctions des usines virales liquides formées par les Mononegavirales – LiquidFact

Pour mener à bien les 6 objectifs du projet, à côté d’approches plus classiques de biologie moléculaire et cellulaire, nous allons utiliser diverses techniques de pointe.
1) La microscopie à super-résolution et microscopie électronique à balayage à faisceau ionique focalisé, seront utilisées pour caractériser l'organisation sub-micrométrique des corps de Negri (CN). La structure des CN sera aussi étudiée par des méthodes utilisant les sources de rayonnement synchrotron (par exemple, la microscopie à rayons X à transmission par balayage ou le µ-SAXS couplé à une imagerie par corrélation).
2) La dynamique des CN sera caractérisée par des approches d’imagerie sur cellules vivantes en utilisant la microscopie confocale à disque rotatif ainsi que des approches de recouvrement de fluorescence après photoblanchiment (FRAP).
3) En utilisant des systèmes reconstitués in vitro et une combinaison de techniques de fluorescence et de RMN, nous identifierons les principes physico-chimiques induisant la SPL et la formation de l’usine virale.
3) Pour caractériser le protéome des CN, nous utiliserons la biotinylation de proximité suivie de l’identification des protéines par spectrométrie de masse. Nous identifierons également les ARN résidents des CN par des approches de cross-linking, immunoprécipitation, et séquençage (NGS).
5) Pour identifier les ribosomes actifs dans la cellule, nous utiliserons des approches de ribopuromycylation et des anticorps liant spécifiquement la puromycine.

Résultats marquants après 18 mois de projet:
1) Reconstitution d’un système minimal in vitro dans lequel la P forme des structures liquides ayant des propriétés proches des CN.
2) Identification de domaines de la N du RABV impliqués dans la séparation de phase liquide.
3) Identification d’une kinase cellulaire impliquée dans la voie de signalisation conduisant à l’induction de l’interféron qui est séquestrée par la P du RABV dans les CN avec comme conséquence l’inhibition de la voie.
4) Démonstration que cette kinase et un certain nombre d’autres acteurs de cette voie forment des condensats protéiques.

L’ensemble de ces résultats va faire l’objet de deux articles en cours de rédaction (soumission en septembre 2021). Le système minimal in vitro est maintenant prêt à être caractérisés finement par des approches de RMN (qui viennent de démarrer) et de fluorescence ou avec des méthodes utilisant les sources de rayonnement synchrotron.
Enfin, durant la période à venir, nous souhaitons développer les approches de marquage de proximité afin de déterminer le protéome des CN mais aussi celui des condensats protéiques formés par les protéines agissant dans la voie de signalisation conduisant à la production d’interféron.

Nevers Q, Albertini AA, Lagaudrière-Gesbert C, Gaudin Y. Negri bodies and other virus membrane-less replication compartments. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 2020 Dec;1867(12):118831. doi: 10.1016/j.bbamcr.2020.118831.

La réplication de nombreux virus se déroule dans des compartiments spécialisés, formés lors de l'infection, appelés usines virales. La nature physicochimique de ceux-ci et les bases moléculaires de leur morphogenèse et leur organisation sont mal comprises.
De nombreux Mononegavirales (MNV) sont pathogènes pour l’homme (virus de la rage -RABV-, virus de la rougeole -MeV-, virus Ebola…). Ces virus ont un génome à ARN simple brin de polarité négative encapsidé par la nucléoprotéine (N) pour former la ribonucléoprotéine associée à l'ARN polymérase dépendante de l'ARN (L) et son cofacteur, la phosphoprotéine (P).
Les usines du RABV sont les corps de Negri (CN), inclusions cytoplasmiques hébergeant la synthèse des ARN viraux (ARNm et ARN génomiques). Nous avons montré que les CN constituent une nouvelle catégorie d'organites liquides sans membrane. Les organites liquides sont formés par séparation de phase liquide (SPL), contribuent à la compartimentation cellulaire et sont impliqués dans un large éventail de processus. Les mécanismes de la SPL sont mal compris.
La nature liquide des usines virales semble être partagée par d’autres MNV. C’est un changement de paradigme qui ouvre de nouveaux champs de recherche dans le domaine de la réplication des MNV et nous invite à revoir l'interaction entre usines virales et immunité innée cellulaire.
Ce projet vise à caractériser la morphogenèse, l'organisation, la composition, la dynamique et les fonctions des usines virales des RABV et MeV. Il regroupe 3 équipes : une de virologues et de biochimistes spécialistes des rhabdovirus, une autre développant de nouvelles méthodes d’imagerie cellulaire sur les sources de rayonnement synchrotron et une troisième développant des approches de pointe en RMN et fluorescence pour étudier la dynamique et les interactions des protéines flexibles avec un focus sur la structure des virus à ARN négatif. Il a six objectifs :
1) Par microscopie à super-résolution et microscopie électronique à balayage à faisceau ionique focalisé, nous caractériserons l'organisation submicrométrique des CN et leur évolution durant le cycle viral. La structure des CN sera aussi étudiée par des méthodes utilisant les sources de rayonnement synchrotron (par exemple, la microscopie à rayons X à transmission par balayage ou le µ-SAXS couplé à une imagerie par corrélation). Nous déterminerons aussi les éléments structuraux des protéines virales requis pour la formation des CN.
2) En utilisant des systèmes reconstitués in vitro et une combinaison de techniques de fluorescence et de RMN, nous identifierons les principes physico-chimiques induisant la SPL et la formation de l’usine virale.
3) Comme la SPL enrichit les CN en facteurs spécifiques, nous caractériserons le protéome des CN par biotinylation de proximité suivie de l’identification des protéines par spectrométrie de masse. Nous identifierons également les ARN résidents des CN.
4) Nous caractériserons l'interaction entre CN et immunité innée cellulaire. En effet, la séquestration des ARN viraux dans les CN pose la question de leur accessibilité aux senseurs de l’infection tels RIG-I ou MDA5. Par ailleurs, les usines liquides constituent une signature d'infection virale et les cellules pourraient avoir développé un mécanisme permettant la détection de telles structures et/ou leur déstabilisation.
5) Les données expérimentales suggèrent que les CN pourraient également abriter la traduction des protéines virales. Nous étudierons où les ARNm viraux sont traduits dans les cellules infectées et s'ils utilisent un mécanisme non conventionnel d'initiation de la traduction pour échapper à l'inhibition de la traduction induite par l'immunité innée.
6) Enfin, les RNP doivent quitter l’usine virale pour former de nouveaux virions. Nous étudierons les bases moléculaires à l’origine de ces processus.
Au-delà de la virologie et de l’immunité innée, ce projet aura un impact général sur notre compréhension de l’assemblage des organites liquides.