Mécanismes proarythmiques dépendant du sodium et du calcium – NaCaR

Pour atteindre les objectifs du projet, nous avons mis en œuvre une stratégie expérimentale multidisciplinaire et multi-échelle combinant des approches moléculaires, cellulaires, tissulaires et à l’échelle de l’organe. Des modèles murins génétiquement modifiés portant des mutations pathogènes de RyR2 associées à la TVPC, une mutation de Nav1.5 associée au LQTS3, ainsi qu’une mutation de la desmine ont été utilisés afin d’étudier les mécanismes arythmogènes dans un contexte physiologique intégré. Ces modèles ont été complétés par des études réalisées sur des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) de patients, cultivés en monocouches ou sous forme de tissus cardiaques tridimensionnels bio-ingéniérés (EHT), garantissant une forte pertinence translationnelle. L’édition du génome par CRISPR/Cas9 a permis de générer des lignées iPSC isogéniques contrôles et mutantes.

Dans un premier temps, les conséquences fonctionnelles des mutations de NCX1 ont été étudiées dans des systèmes d’expression hétérologues à l’aide d’enregistrements patch-clamp et de tests de captation du calcium ⁴⁵Ca dépendants du sodium. Dans les modèles de TVPC, la dynamique du calcium intracellulaire a été analysée par des techniques avancées d’imagerie confocale et de super-résolution, permettant l’étude quantitative des étincelles calciques, des ondes calciques et de la récupération locale de la libération calcique avec une résolution spatiale et temporelle élevée. Des approches optiques innovantes, incluant le découplage calcique biphotonique, ont été utilisées pour sonder la réfractarité et la sensibilité de la libération calcique induite par le calcium in situ. Pour les autres modèles pathologiques, les transitoires calciques ont été enregistrés par cartographie optique. Pour l’ensemble des modèles, les enregistrements électrophysiologiques cellulaires (patch-clamp et/ou microélectrodes intracellulaires) ont été combinés à des cartographies optiques et électriques sur cœurs isolés afin d’évaluer les propriétés des potentiels d’action, les patterns de conduction et la dynamique de repolarisation en conditions basales et sous stimulation adrénergique. La modélisation computationnelle a permis d’intégrer les données expérimentales et de tester des hypothèses mécanistiques reliant les perturbations du calcium et du sodium à l’instabilité électrique. Enfin, des interventions moléculaires ciblées, incluant la modulation de l’expression de FKBP12.6, l’utilisation de peptides et d’agents pharmacologiques (certains dérivés de venins) ont été appliquées afin d’identifier les déterminants de la susceptibilité aux arythmies et d’évaluer des stratégies thérapeutiques potentielles. Selon les projets, ces études fonctionnelles ont été complétées par des approches de biologie moléculaire, incluant Western blot, immunomarquage, ainsi que des analyses transcriptomiques et protéomiques.

Le projet a permis d’obtenir plusieurs résultats majeurs améliorant la compréhension des arythmies ventriculaires dépendantes du calcium. Au niveau subcellulaire, les mutations pathogènes de RyR2 augmentent la sensibilité de la libération calcique et raccourcissent sa réfractarité, entraînant davantage d’événements spontanés. Ces anomalies résultent du gating du canal et d’un remodelage nanométrique des unités de libération calcique, incluant une altération du couplage RyR2-junctophiline-2. Au niveau cellulaire, la fuite calcique accrue favorise post-dépolarisations précoces et retardées, surtout sous stimulation adrénergique. L’équilibre entre recapture et fuite calcique apparaît comme déterminant pour la signalisation arythmogène. Aux échelles tissulaire et du cœur entier, les anomalies calciques ne sont pas seulement des déclencheurs : des dépolarisations sous-seuil ralentissent localement la conduction et augmentent la dispersion d’activation, tandis que l’allongement du potentiel d’action réduit la réserve de repolarisation, créant un substrat électrique vulnérable aux arythmies par réentrée et déclenchées. Des facteurs modulant les voies calciques ont été identifiés, avec des effets protecteurs ou délétères dose-dépendants, soulignant l’importance d’une régulation fine.

Dans le modèle LQTS3, la Huwentoxine-IV, inhibiteur de canaux sodiques neuronaux dans le sous-espace tubules T–réticulum sarcoplasmique, prévient les arythmies sans corriger la repolarisation, confirmant le rôle clé de ces canaux dans la régulation du calcium. Le Maurocalcine s’est montré moins efficace. La mutation SCN5A dans les fibroblastes ventriculaires altère le sodium et le calcium, activant la voie calcineurine-NFAT et favorisant la prolifération des fibroblastes, contribuant aux arythmies. Les cinq mutations NCX1 réduisent le courant entrant, raccourcissant le potentiel d’action des cardiomyocytes iPSC. La modélisation a montré que cette diminution altère la libération calcique SR et la repolarisation précoce, reproduisant le phénotype du syndrome de repolarisation précoce à l’ECG.

En revanche, pour la mutation Desmine R406W, malgré des altérations de régulateurs calciques, la dérégulation calcique n’est pas impliquée : les arythmies résultent de réentrées favorisées par une courte réfractarité et une conduction ralentie.

Les résultats de ce projet redéfinissent le rôle du calcium intracellulaire dans l’arythmogénèse ventriculaire en démontrant sa contribution double, à la fois comme déclencheur et comme substrat de l’instabilité électrique. Ces conclusions ont des implications importantes pour la prise en charge de la TVPC, du LQTS3 et d’autres arythmies liées aux anomalies de la signalisation calcique.

En reliant des défauts moléculaires et nanostructuraux au comportement électrique du cœur entier, ce travail fournit un cadre conceptuel pour le développement de stratégies thérapeutiques spécifiques des mutations et fondées sur les mécanismes. L’identification de l’altération de la réserve de repolarisation et des troubles de conduction comme processus dépendants du calcium ouvre de nouvelles perspectives thérapeutiques dépassant le cadre classique du blocage des canaux sodiques.

Plus largement, les mécanismes mis en évidence dans la TVPC et le LQTS3 sont hautement pertinents pour les pathologies cardiaques acquises telles que l’insuffisance cardiaque, dans lesquelles la dérégulation du calcium et les arythmies coexistent fréquemment. Les approches et concepts développés dans ce projet pourraient ainsi nourrir de futures recherches et innovations thérapeutiques dans des maladies cardiovasculaires fréquentes.

Les travaux futurs viseront à traduire ces avancées mécanistiques en traitements ciblés, à affiner la stratification du risque sur la base des profils de signalisation calcique, et à développer des approches de médecine de précision adaptées à des défauts moléculaires spécifiques.

Dans le modèle de LQTS3, une perspective consiste à utiliser une approche de photopharmacologie afin de cibler spécifiquement, au niveau cardiaque, les canaux sodiques neuronaux sans affecter le cerveau, comme cela a déjà été réalisé pour une autre cible (canal hERG). À court terme, avant la soumission de notre manuscrit sur la prévention pharmacologique des arythmies dans le modèle LQTS3, nous prévoyons d’évaluer si une forme modifiée du Maurocalcine présente une efficacité supérieure à celle de la forme E12A utilisée.

L'objectif principal de ce projet est d'élucider les mécanismes des arythmies ventriculaires impliquées dans la mort subite cardiaque (MSC), qui représente environ 15% des décès dans le monde. La MSC peut survenir sur un cœur structurellement normal pour lequel la tachyarythmie létale est le plus souvent due à une canalopathie, c'est-à-dire une maladie génétique affectant un canal ionique. Nous nous concentrerons sur deux syndromes dépendant de la stimulation adrénergique : la tachycardie ventriculaire polymorphe catécholaminergique (CPVT) et le syndrome du QT long de type 3 (LQTS3). La CPVT est une maladie génétique sévère qui se manifeste par des syncopes ou une MSC chez des enfants et de jeunes adultes lors d'un stress physique ou émotionnel et en l'absence de maladie cardiaque structurelle. La plupart des mutations causales de la CPVT se situent dans le gène codant le canal Ca2+ du réticulum sarcoplasmique, le récepteur de la ryanodine de type 2 (RyR2). D'autres mutations affectent les protéines régulatrices de RyR2, ce qui indique que la CPVT est liée au dysfonctionnement de RyR2. Les ouvertures aberrantes du RyR2 pendant la diastole produisent une élévation de [Ca2+]i qui est rapidement extrudée par l'échangeur sodium/calcium électrogénique, produisant ainsi des post-dépolarisations retardées à l'origine de l'activité déclenchée et de l'arythmogénèse de la CPVT. Lorsque les bloqueurs ß-adrénergiques (première option thérapeutique) ne confèrent pas une protection suffisante, la flécaïnide, un bloqueur du canal Na+, est ajoutée avec une bonne efficacité, mais une fenêtre thérapeutique étroite. Bien qu'un effet direct de la flécaïnide sur RyR2 ait été invoqué comme mécanisme d'action, ce point reste controversé. Nous émettons donc l'hypothèse que l'altération de l'homéostasie sodique contribue à l'arythmogénicité de la CPVT. C'est un mécanisme totalement inexploré.
Le LQTS est un trouble héréditaire de l'activité électrique cardiaque. Il est causé par une repolarisation retardée des cardiomyocytes ventriculaires, ce qui entraîne un allongement de l'intervalle QT sur l'ECG et une sensibilité accrue à la tachycardie ventriculaire polymorphe et à la fibrillation ventriculaire. Les mutations dans les gènes codant pour les canaux ioniques ou leurs sous-unités accessoires sont liées à différents types de LQTS. Des mutations dans le canal Na+ Nav1.5 (gène SCN5A), qui altèrent son inactivation, induisant un courant Na+ persistant, sont impliquées dans le LQTS3. Fait intéressant, nos données récemment publiées montrent que le Ca2+ intracellulaire est augmenté dans les cardiomyocytes de souris LQTS3 (Scn5a+/?QKP) probablement via l'activité de l'échangeur Na+/Ca2+ extrudant l'excès de Na+. Nous formulons l'hypothèse nouvelle qu'une dérégulation du Ca2+ intracellulaire contribue à l'arythmogénicité du LQTS3.
Rassemblant un groupe d'experts de renommée internationale, nous proposons un projet original et multidisciplinaire axé sur le rôle clé de [Ca2+]i et [Na+]i dans la genèse d'arythmies sévères, en utilisant à la fois des modèles de souris et de lapins de CPVT ou LQTS3 et des cardiomyocytes différenciés à partir des cellules souches pluripotentes induites des patients présentant les mêmes mutations. Au-delà des maladies rares telles que la CPVT et le LQTS3, une dérégulation du Ca2+ et du Na+ a été observée dans les maladies cardiaques acquises comme l'insuffisance cardiaque, où les arythmies cardiaques représentent la moitié des décès. Les nouvelles connaissances acquises sur ces maladies rares peuvent également être bénéfiques pour les maladies courantes pour lesquelles le canal affecté peut présenter une altération de l'expression et/ou de la fonction, comme l'insuffisance cardiaque, pour laquelle la MSC est responsable d'environ la moitié des décès. Ainsi, l'élucidation des mécanismes de la CPVT et du LQTS permettra d'acquérir les connaissances essentielles pour proposer de nouvelles thérapies antiarythmiques efficaces.