Régulation redox de l'activité des HDAC de plantes en réponse au changement climatique – REPHARE

Premièrement, les méthodes basées sur les anticorps (western blots) permettront la détection de la sulfénylation de Cys (détection d'adduits Cys-dimédone), des liaisons disulfure (gels non réducteurs) et de la S-nitrosylation (commutateur de biotine). Deuxièmement, la spectrométrie de masse (MS) permettra de confirmer les modifications et d'identifier les résidus Cys impliqués. La SEP peut également révéler une Cys S-glutathionylation qui pourrait participer à la régulation redox des HDAC. Troisièmement, en utilisant des protéines recombinantes produites dans E coli, des tests in vitro permettront d'examiner l'impact des modifications redox sur l'activité HDAC et d'identifier des régulateurs de protéines redox tels que les thiorédoxines (TRX), les glutarédoxines (GRX) et leurs systèmes réducteurs, la NADPH-TRX réductase et le glutathion (GSH), respectivement (protéines redox déjà obtenues par le partenaire 2). Quatrièmement, des constructions HDAC marquées (HDA19-HA, HDA9-HA et HDA6-HA) seront introduites dans des plantes mutantes de gènes régulateurs redox (déjà disponibles dans le laboratoire du partenaire 2) et l'impact des mutations sur l'état redox des HDAC marqués sera être examiné comme mentionné ci-dessus.

Nous avons testé la S-nitrosylation (SNO) ou la S-glutathionylation (SSG) de HDA6, HDA9 et HDA19. Les trois protéines ont présenté une SNO. Le niveau de SNO de HDA19 augmente chez les plantes cultivées à haute température (27°C) par rapport à 20°C et sous d'autres stress (traitement SA, 3-AT). De plus, le SNO de HDA19 augmente lorsque les plantes sont traitées avec du GSNO mais disparaît lorsqu'elles sont traitées avec le piégeur de GSNO cPTIO. Les trois protéines présentent une localisation à la fois cytoplasmique et nucléaire. Le stress améliore la localisation nucléaire de HDA19 et le SNO de sa fraction nucléaire. De plus, nous avons effectué une analyse par spectrométrie de masse des protéines HDAC isolées de plantes de complémentation qui ont révélé au moins 4 résidus Cys dans HDA19, 1 Cys dans HDA9 et HDA6. La mutation ponctuelle d'un des résidus SNO Cys dans HDA19 réduit les niveaux de SNO, principalement de la fraction cytoplasmique de la protéine, mais n'a montré aucun effet sur la fraction nucléaire. Des mutations ponctuelles de résidus SSG Cys ont également été réalisées sur HDA6. Des plantes exprimant ces constructions sont en cours d'analyse pour évaluer l'impact de ces mutations sur l'activité de la protéine HDA6, aux niveaux phénotypique et moléculaire. Nous avons introduit des constructions HDAC marquées (HDA19-HA, HDA9-HA et HDA6-HA) dans plusieurs plantes mutantes redox (ntra, cat2, gsnor, grxs17, etc.). Chez les mutants cat2, gsnor, HDA19 affichait des augmentations de SNO, tandis que dans les arrière-plans ntra ou grxs17, HDA19 SNO était réduit (en ntra) ou éliminé (en grxs17). Dans le cytoplasme, HDA19 et HDA6 existent probablement dans un complexe protéique. L'analyse MS a révélé qu'une protéine liée à l'oxydoréduction est associée à HDA19 dans le complexe. L'analyse de la localisation de HDA6-GFP et HDA19-GFP à haute température suggère que les deux protéines s'accumulent dans les granules de stress cytosoliques (SG) après le stress.

La plupart des matériaux biologiques ont été construits. Trois articles ont été publiés et de nombreuses données préliminaires ont été obtenues. Surtout, nous avons identifié une interaction directe entre des régulateurs redox et des HDAC, ce qui permettra de caractériser des mécanismes précis de régulation redox de l'activité HDAC en réponse à une température élevée.

1. X Cui, Y. Zheng, Y Lu, E. Issakidis-Bourguet, DX Zhou (2021) Metabolic control of histone demethylase activity in plant response to high ambient temperature. Plant Physiology 23;185(4):1813-1828
2. Y Shen, T Lei, X Cui, X Liu, S Zhou, Y Zheng, F Guérard, E Issakidis-Bourguet, DX Zhou (2019) Arabidopsis histone deacetylase HDA15 directly represses plant response to elevated ambient temperature. Plant J 100(5):991-1006. doi: 10.1111/tpj.14492
3. Martins L, Knuesting J, Bariat L, Dard A, Freibert SA, Marchand CH, Young D, Dung NHT, Debures A, Saez-Vasquez J, Lemaire SD, Lill R, Messens J, Scheibe R, Reichheld JP#, Riondet C (2020) Redox modification of the Fe-S glutaredoxin GRXS17 activates holdase activity and protects plants from heat stress. Plant Physiol. Oct 2020, 184 (2) 676-692;

Les températures ambiantes élevées dues aux changements climatiques ont un impact sur la croissance et la survie des plantes. Des données récentes indiquent que la modification de la chromatine est un processus essentiel de reprogrammation de l'expression des gènes pendant la réponse des plantes à une température de croissance élevée. Les histone-désacétylases (HDAC), régulant les niveaux d'acétylation des histones, jouent un rôle important dans l'adaptation des plantes à leur environnement. De plus, les HDAC sont également impliquées dans la désacétylation de protéines non-histones, telles que des enzymes métaboliques et des facteurs de transcription pour contrôler leur activité. Nos données préliminaires indiquent que les membres des HDAC d'Arabidopsis jouent des rôles distincts dans la réaction des plantes aux températures élevées. De plus, nous avons constaté qu'une température élevée modifie l’environnement redox des cellules végétales qui régule la localisation sub-cellulaire des HDAC et leur activité de désacétylase.
L'objectif de ce projet est d'élucider les mécanismes moléculaires d'interaction entre l'oxydoréduction cellulaire et la modification de la chromatine régulant la réponse des plantes à des températures élevées. En particulier, ce projet vise à élucider comment l'environnement redox cellulaire régule l'activité des HDAC pour contrôler l'acétylation de lysine des protéines histones et non-histones, impliquées soit dans la régulation épigénétique de l'expression génique soit dans le métabolisme et/ou la signalisation, au cours de la réponse des plantes aux températures ambiantes élevées, ainsi qu'à identifier et étudier les régulateurs redox impliqués.
Nous proposons, d'abord, d'identifier les modifications post-traductionnelles de type redox des HDAC d'Arabidopsis dans des conditions de températures ambiantes normale et élevée par des approches biochimiques et de spectrométrie de masse. Ensuite, nous examinerons les effets des modifications redox sur l'activité enzymatique des HDAC, leur localisation subcellulaire, et le fonctionnement des plantes en réponse à la température élevée, grâce à des plantes produisant des protéines HDAC étiquetées, sauvage ou mutées, pour les résidus sensibles au redox. Ensuite, nous identifierons les régulateurs redox impliqués dans les modifications des HDAC par des approches biochimiques et génétiques, et étudierons leur rôle dans la réponse des plantes aux températures élevées. Puis, nous évaluerons les effets des modifications redox sur la fonction épigénétique des HDAC en termes de structure de la chromatine, de modifications des histones à l'échelle du génome, de méthylation de l'ADN, et d'expression génique, par séquençage à haut débit et par des approches en biologie cellulaire. Enfin, nous étudierons l'effet des modifications redox des HDAC dans le domaine encore très peu connu de la régulation de l'acétylation de protéines non-histones, afin d'identifier les enzymes métaboliques clés et les protéines de signalisation régulées par les HDAC, et impliquées dans la réponse des plantes aux températures élevées.
Ce projet visant à élucider les liens entre les réseaux redox - épigénétique - métabolique permettra de mieux comprendre comment les plantes s'adaptent, ou résistent, à un environnement changeant. Plus précisément, le projet permettra d’établir les bases moléculaires de la régulation des HDAC en réponse au stress et comment les modifications des thiols modulent leurs fonctions.
Les résultats obtenus dans le cadre de ce projet permettront d'établir un lien entre la signalisation redox, la régulation épigénétique et l'adaptation des plantes à l’environnement, et de révéler les mécanismes moléculaires des interactions sous-jacentes. Le projet REPHARE rassemble les expertises complémentaires dans les domaines de la régulation épigénétique et de la signalisation redox des deux partenaires qui ont déjà construit une base solide pour mener à bien le projet.