Etudes structurales et fonctionnelles de l'import et le transfert à travers l'espace inter-membranaire des protéines membranaires mitochondriales – MitoMemProtImp

Dans le but d'obtenir une description complète de l'importation de protéines membranaires du ciblage cytosolique vers les insertases, nous étudierons dans ce projet une variété de protéines membranaires différentes, des familles alpha-hélicoïdales et bêta-barils, y compris les protéines membranaires mitochondriales mitochondriales avec des domaines solubles .
Nous utilisons la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire, la diffusion des rayons X aux petits angles, les simulations de dynamique moléculaire et d'autres méthodes biophysiques in vitro afin d'obtenir une vue structurelle des structures de ces protéines membranaires liées à différents chaperons. Le résultat de cette approche in vitro sera une description complète des sites de liaison, de la dynamique et de la structure de plusieurs complexes. Sur la base de ces résultats, nous concevons des mutants qui auront un impact sur les affinités de liaison, les structures et la dynamique. Nous vérifierons ces mutants in vitro et, en parallèle, testerons ces protéines in vivo. Par des tests d'importation de protéines membranaires chez la levure, nous établirons l'importance des sites de liaison que nous avons identifiés in vitro, et établirons ainsi la pertinence biologique des structures.

Les chaperons sont essentiels pour aider au repliement des protéines et pour transférer des protéines peu solubles vers leurs emplacements fonctionnels dans les cellules.
Dans une première étude, nous avons décrypté les différences entre les deux chaperons de l'espace inter-membranaire mitochondrial. Les interactions hydrophobes conduisent à une liaison chaperon-client promiscuité, mais notre compréhension de la façon dont les interactions supplémentaires permettent la spécificité du client est rare. Ici, nous déchiffrons ce qui détermine la liaison de deux chaperons (TIM8 · 13 et TIM9 · 10) à différentes protéines membranaires intégrales, le transporteur mitochondrial tout transmembranaire Ggc1 et Tim23, qui a un domaine hydrophile désordonné supplémentaire. En combinant des simulations RMN, SAXS et de dynamique moléculaire, nous déterminons les structures des complexes Tim23 / TIM8 · 13 et Tim23 / TIM9 · 10. TIM8 · 13 utilise des ponts salins transitoires pour interagir avec la partie hydrophile de son client, mais ses interactions avec la partie transmembranaire sont plus faibles que dans TIM9 · 10. Par conséquent, TIM9 · 10 surclasse TIM8 · 13 dans la liaison des clients hydrophobes, tandis que TIM8 · 13 est accordé à quelques clients avec des parties à la fois hydrophiles et hydrophobes. Notre étude illustre comment les chaperons affinent l'équilibre entre la promiscuité et la spécificité.
Nous avons ensuite étudié en outre comment le chaperon essentiel TIM9 · 10 · 12, s'assemble. Fait intéressant, nous avons identifié que les sous-unités de ce chaperon hexamérique sont en échange continu entre les états monomère et hexamère.
Dans une autre étude, les partenaires français et allemands ont révélé qu'une classe de protéines membranaires mitochondriales récemment identifiées, les porteurs de pyruvate mitochondrial, est importée via une voie d'importation qui avait été précédemment décrite pour d'autres protéines.

Ayant avancé sur les mécanismes de la fonction chaperon dans l'espace inter-membranaire mitochondrial, nous allons maintenant comprendre comment ces chaperons interagissent avec les domaines récepteurs pour une intégration plus poussée des protéines membranaires dans la membrane.

(1) Sucec, I., Wang, Y., Dakhlaoui, O., Weinhäupl, K., Jores, T., Costa, D., Hessel, A., Brennich, M., Rapaport, D., Lindorff-Larsen, K., Bersch, B., Schanda P. Structural basis of client specificity in mitochondrial membrane-protein chaperones. Sci. Adv. 2020, 6, 51: eabd0263
(2) Weinhäupl, K., Wang, Y., Brennich, M., Lindorff-Larsen, K., Schanda P*. Architecture and assembly dynamics of the essential mitochondrial chaperone complex TIM9·10·12. Structure, 2021, in press.
(3) Rampelt H, Sucec I, Bersch B, Horten P, Perschil I, Martinou J-C, van der Laan M, Wiedemann N, Schanda P, Pfanner N.* The mitochondrial carrier pathway transports non-canonical substrates with an odd number of transmembrane segments. BMC Biology, 18:2

Les mitochondries sont essentielles pour la biogenèse des clusters fer-soufre, cruciales pour l'apoptose, impliquées dans de nombreuses voies métaboliques et bien connues pour leur rôle dans la synthèse de l'ATP. Tous ces processus dépendent des canaux tonneaux-beta dans la membrane externe et des porteurs de métabolites alpha-hélicoïdaux dans la membrane interne. Comme la grande majorité des protéines mitochondriales, tous ces canaux et transporteurs sont codés dans le noyau et traduits sur des ribosomes cytosoliques. Les protéines précurseurs mitochondriales classiques contiennent une pré-séquence N-terminale qui est nécessaire et suffisante pour le ciblage et l'import, et qui est clivée après l'import pour produire la protéine mature. Le but de ce projet est une description complète de l'importation de précurseurs de protéines membranaires mitochondriales avec des signaux de ciblage internes. Après la translocation à travers la translocase de la membrane externe (TOM), ces précurseurs hydrophobes sont triés à travers l'espace intermembranaire aqueux. Par la suite, les précurseurs bêta-tonneau sont insérés à l'aide de la machinerie de tri et d'assemblage (SAM) dans les supports de métabolites externes et alpha-hélicoïdaux par la translocase de support (TIM22) dans la membrane interne. Les principales questions ouvertes sont les mécanismes de ciblage spécifiques des trois récepteurs Tom pour les protéines membranaires avec des signaux de ciblage interne, la base structurelle du chaperon protéique dans l'espace intermembranaire par le système chaperon TIM et le transfert aux complexes membrane insertase.
Par une approche intégrée de biologie structurale et biochimique, nous analyserons la contribution des différents récepteurs Tom redondants pour le ciblage des protéines tonneau-beta et des transporteurs de métabolites. En outre, nous allons déterminer le mécanisme de transfert de précurseurs de protéines membranaires par le système chaperon TIM à partir du complexe TOM à travers l'espace intermembranaire aqueux aux complexes SAM et TIM22. Nous déterminerons la structure et la dynamique des complexes formés par les précurseurs protéiques membranaires et les domaines récepteurs et chaperons en combinant RMN, SAXS et d'autres approches biophysiques, déterminer les affinités de liaison relative, et étudier le transfert de préprotéine des chaperons au Sam50-POTRA domaine et au récepteur Tim54 du complexe TIM22 au niveau structurel. Ces approches biophysiques et structurelles seront complétées par la génération de mutants ponctuels spécifiques au site des protéines du récepteur et du chaperon et leur analyse in vivo et in vitro par des tests de croissance et des expériences d'importation dans des mitochondries isolées. Cette étude complétera les connaissances sur l'importation des protéines précurseurs mitochondriales classiques par une description en profondeur de l'importation des deux classes de protéines membranaires les plus abondantes de mitochondries et cela révélera des principes importants aussi pour les chloroplastes et les bactéries Gram négatif.