Protéomique haute performance par réduction de la complexité isotopique in vivo – SLIM-labeling

Nos approches sont de deux type: expérimentales et computationnelles.
Les approches expérimentales consistent en la production d'échantillons biologiques enrichis, ou non, en carbone 12, l'isotope léger du carbone. Ces échantillons servent à tester la méthode de quantification des variations de protéome en «bottom-up«, en établissant en particulier des gammes de concentration du carbone 12 par mélanges contrôlés d'échantillons marqués et non marqués. Les systèmes biologiques testés sont la bactérie Escherichia coli, les levures Saccharomyces cerevisiae et Candida albicans, des lignées cellulaires en culture de drosophile et humaines, et le nématode Caenorhabditis elegans.
Les approches computationnelles peuvent être divisées en trois classes. La première classe est relative au traitement du signal expérimental. Nous avons cherché des solutions robustes pour pouvoir extraire, à partir des fichiers «machine« l'intensité des isotopologues des massifs isotopiques des peptides ayant donné une identification positive dans les analyses en couplage chromatographie liquide/spectrométrie de masse. Nous avons établi une collaboration très efficace avec le développeur d'un algorithme performant pour réaliser cette opération. La deuxième classe a consisté en l'établissement du modèle théorique permettant de développer des approches quantitatives en SLIM-Labeling. La troisième classe a consisté en la mise au point d'un pipeline d'analyse permettant de produire les données quantitatives expérimentale.

Les principaux résultats sont:
* un solide modèle théorique original pour la quantification en Bottom-Up de protéomes complexes reposant sur le marquage métabolique SLIM
* un pipeline d'analyse intégral, robuste et rapide n'utilisant que des ressources computationnelle open-source implémentées dans un environnement de travail KNIME.
* Des données biologiques originales sur les variations de protéome chez la levure Sacchoryces cerevisiae mettant en particulier en évidence les changements induits par la présence d'acides aminés exogènes nécessaires pour supplémenter des auxotrophies classiques portées par des souches de laboratoire
* des améliorations significatives du taux d'identification de protéines dans des protéomes simples, mais aussi dans des protéomes complexes (eucaryotes supérieurs)
* des résultats préliminaires mais robustes prouvant la faisabilité de l'utilisation du SLIM-Labeling pour la quantification des protéines intactes dans des analyses de type Top-Down

La méthode de quantification des variations de protéomes par des approches «bottom-up« utilisant la stratégie de SLIM-Labeling est maintenant bien établie, et complètement opérationnelle. Elle est maintenant applicable sur des cellules dont la croissances dépend de l'apport exogène d'acides aminés non enrichis en carbone 12, telles que les cellules humaines. Des pipelines d'analyse automatique, implémentés dans un environnement KNIME, sont mis à la disposition de la communauté scientifique. Cela ouvre des perspectives importantes pour un grand nombre de projets de recherche ambitieux en bilogie et médecine.
La poursuite de ce travail sera en priorité d'étendre ces méthodes d'analyse à l'étude des variations de protéomes à l'échelle des protéines intactes. Pour cela, nous sommes en train de développer une méthode complètement inédite, utilisant le SLIM-Labeling, qui permet des analyses quantitatives en «Top-down«, même lorsqu'il n'est pas possible d'ontenir l'identification précise des protéines quantifiées. Les outils en cours de développement permettent de plus d'offrir un nouveau score de pertinence lors de l'utilisation d'algorithmes d'identification des protéines.
Ce domaine de recherche est actuellement l'un des plus actif en protéomique.

Deux publication en cours de finalisation au 12/04/2020

L’un des problèmes les plus complexes en biologie est d’analyser la dynamique des variations de structure et de composition de protéomes complexes, pour mieux comprendre les mécanismes de régulation de l’expression génique dans des conditions normales ou pathologiques. En utilisant du glucose ne contenant que des atomes de 12C, nous avons développé une méthode très simple de marquage métabolique (le SLIM-labeling) qui permet d’analyser avec une très grande efficacité des protéomes complexes, aussi bien par l’analyse des peptides que par l’analyse des protéines intactes. Nous proposons maintenant de développer une suite logicielle adaptée à l’analyse des données obtenue, de valider nos nouvelles approches quantitatives par des analyses statistiques rigoureuses, et d’étendre la méthode à l’analyse quantitative des variations d’abondance et d’état des protéines intactes, dans des systèmes biologiques complexes, des organismes pluricellulaires et des cultures de cellules humaines.