Nouvelles sondes pour la détection de Métallo protéases par spectrométrie de masse – ProMaP

-> synthèse et caractérisation des sondes chimiques capables de transférer un groupement fluorescent
-> evaluation in vitro sur un jeu de MMP, électrophorèse et spectrométrie de masse
-> determination du rendement de marquage et de la ou des positions modifiées au sein de la protéine cible
-> les sonde «lead« sont décliné en sondes capables de transférer un tag de masse
-> détermination, après digestion protéolytique, des seuils de détection dans différents milieux
-> les sondes «hit« seront encapsulées pour une évaluation systémique

-> Synthèse et caractérisation de 11 sondes incorporant un groupement fluorescent à transférer aux métallo protéases.
-> Évaluation de leur réactivité/sélectivité sur un jeu de 8 métallo protéases
-> Identification de sondes capables de cibler efficacement et sélectivement les hMMP-3/8/9/10/12/13 et la mMMP12.
-> Mise en place des conditions de digestions et d’analyse en spectrométrie de masse (MS et séquençage MS) des MMP marquées.
-> Détermination des positions modifiées de façon covalente au sein des des MMP.
-> Évaluation des paramètres gouvernant la réactivité des lysines au sein des MMP
-> Détermination des fragments signatures pour MMP9, 12 et 13.
-> Synthèse de deux sondes incorporant une étiquette de masse, évaluation sur MMP9 et MMP12.
-> Validation du transfert par ces deux sondes de l’étiquette de masse sur hMMP9, hMMP12 et mMMP12.
-> Synthèse des fragments signatures tagués et non tagués de hMMP12 et hMMP9
->Détermination de la limite de sensibilité de détection en MALDI MS et MS/MS dans différentes conditions.
->Détermination de la limite de détection en MALDI MS et MS/MS sur coupes de tissus.

1) Compléter l’arsenal de sondes pour cibler l’ensemble des MMP-> M20
2) Conception d’une librairie de sondes avec un tag de masse capable de cibler un maximum de MMP-> M24
3) Conception d’une nouvelle génération de sonde transférant un groupement prosthétique modifiable par chimie Bio orthogonale : évaluation de différentes étiquettes de masse et de conditions d’ionisation-> M30
4) Optimisation des conditions de digestions in vitro -> M24
5) Évaluation et validation des sondes dans fluides biologiques et sur coupes de tissus-> M30
6) Optimisation des conditions de digestions sur tissu -> M24
7) Validation de la méthodologie MS (détection des fragments signature) en protéome complexe : extraits cellullaires (thioglycollate-stimulated macrophages, 4T1 Metastatic Mammary Carcinoma Model) et Bronco-alveolar lavage (BAL) LOD et LOQ ->M30
8) Encapsulation de sondes dans micelles -> M32
9) Évaluation systémique des sondes encapsulé -> M38

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Patent in 2021

Le but de ce projet est de développer une nouvelle génération de sondes chimiques permettant la détection sensible des formes actives de métallo protéinases présentes en très faible abondance en milieux complexes et in vivo. Ces nouvelles sondes incorporeront dans leur structure un motif de reconnaissance, un lien réactif et une étiquette pour une analyse ciblée en spectrométrie de masse. Cette étiquette sera introduite de façon sélective au sein du site actif des métallo protéinases et sera compatible avec une analyse directe des fluides biologiques ainsi qu’une analyse sur coupes de tissu. Les métallo protéinases modifiées de façon covalente seront ensuite digérées et le mélange de fragments peptidiques résultant sera analysé en conditions discriminantes d’ionisation et de désorptions assistées par laser. Dans ces conditions, les fragments modifiés par l’étiquette seront distingués préférentiellement des fragments non modifiés. Cette approche devrait ainsi nous permettre d’une part de distinguer les formes actives de métallo protéinases des autres formes inactive ou inactivées et d’autre part de les quantifier. Cette stratégie de protéomique  guidée sera évaluée in vitro mais également in vivo à travers l’encapsulation des sondes chimiques dans des nanoparticules. Ceci devrait nous permettre pour la première fois d’étudier les métallo protéinases dans leur environnement natif et donc de mieux appréhender leur rôle en conditions physiologiques et pathologiques.