Thérapies Innovantes contre la Toxoplasmose et le Paludisme Dirigées vers Nouvelles Cibles – NovoTargetParasite

- Production de cibles protéiques : nous utilisons la bioinformatique structurelle pour prédire des domaines des protéines. Nous exprimons les protéines des parasites dans les bactéries. En cas de problème, d'autres systèmes tels que les baculovirus peuvent être utilisés. Sinon, les protéines peuvent être obtenues par marquage d'épitope de la protéine endogène et culture de grands volumes de parasites.
- Caractérisation biophysique : Les protéines purifiées sont utilisées pour etudier leur interactions avec des composés intéressants. Nous utilisons la calorimétrie, la fluorescence, la thermophorèse ou d'autres techniques biophysiques pour déterminer l'affinité des composés avec leurs cibles. La stabilité des protéines est également étudiée par calorimétrie différentielle à balayage (DSC), fluorimétrie différentielle à balayage (DSF) ou dichroïsme circulaire (CD).
- Études structurelles : Les protéines valides sont utilisées dans les essais de cristallisation et les structures des complexes protéiques avec les inhibiteurs seront résolues par cristallographie aux rayons X (ESRF). Cela nous aide à comprendre le mécanisme d'inhibition et à orienter la conception de médicaments basés sur la structure des nouveaux dérivés afin d'améliorer la puissance/sélectivité des composés initialement touchés.
- Essais d'activité cellulaire : Nous utilisons la spectroscopie à haut débit pour tester l'efficacité des nouveaux composés à inhiber la croissance des parasites. Cela permet de déterminer les valeurs d’ IC50 et de bien décrire les phénotypes.
- Identification des cibles et édition des gènes : En utilisant CRISPR/Cas9, nous pouvons introduire des mutations ponctuelles ou éliminer des gènes parasitaires d'intérêt. Grâce à cette nouvelle technologie fascinante, nous pouvons évaluer, dans le contexte pertinent in vivo, l'effet de mutations de gènes spécifiques sur la résistance des parasites à un médicament, ou déterminer l'essentialité de certains gènes.

Nous avons purifié la protéine CPSF3 et l'avons utilisée dans des expériences biochimiques pour étudier la fonction présumée de la CPSF3. Plusieurs substrats d'ARNm contenant le signal de polyadénylation canonique (AAUAAA) et un site de clivage (CA) ont été utilisés pour valider que Cryptosporidium CPSF3 est bien une endonucléase. La réalisation de ces expériences en présence de l'inhibiteur AN3661 a confirmé que CPSF3 est la cible de ce composé. Ces informations ont été très précieuses pour concevoir des criblages de cristallisation dans le but de déterminer la structure de CPSF3 et de son complexe avec l'inhibiteur AN3661.
Cryptosporidium CPSF3 a été cristallisé et les structures des complexes protéiques avec les inhibiteurs ont été résolues par cristallographie aux rayons X. Nous avons déterminé les structures cristallines à haute résolution du Cryptosporidium CPSF3 non lié et d'un complexe avec AN3661 à des résolutions respectives de 1,6 et 2,0 Å. Cela nous a permis de comprendre enfin le mécanisme d'inhibition du CPSF3 par benzoxaboroles. La structure cristalline du complexe CPSF3-AN3661 dévoile les bases moléculaires d'un mécanisme sans précédent via l'inhibition de l'activité mRNAse du CPSF3 dépendant du métal chez les parasites.
L'oxaborole AN3661 se lie directement au site catalytique du CPSF3 et interagit avec les atomes de zincs via les deux hydroxyles et l'oxygène-1 du cycle oxaborole, déplaçant en même temps les molécules d'eau impliquées dans la catalyse. Par conséquent, le mécanisme d'inhibition consiste à capturer l'activité mRNAase du CPSF3 dépendant du métal par le bore chargé négativement qui adopte une configuration tétraédrique et augmente sa nucléophilie vers le centre du métal. Cela permet de compléter la coordination octaédrique des atomes de zinc avec des distances optimales (2,1-2,3 Å), ce qui concurrence efficacement les molécules d'eau catalytiques et bloque le clivage de la liaison phosphate du substrat ARNm.

La réalisation rapide d'un objectif principal, la détermination de la structure de la cible CPSF3 plus tôt que prévu, nous permettra de concentrer les travaux sur les autres objectifs principaux, notamment sur l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques de parasites apicomplexes qui pourraient être utilisées pour le développement de nouvelles molécules antiparasitaires. Notre découverte de CPSF3 en tant que protéine clé pour le déplissage de l'ARNm et donc en tant que protéine essentielle pour la vie de ces parasites, ainsi que comme excellente cible thérapeutique, a attiré notre attention sur l'étude d'autres protéines impliquées dans le traitement de l'ARNm qui pourraient également être des cibles médicamenteuses présumées. Nous émettons l'hypothèse que le ciblage de l'autre enzyme principale de ce processus, la poly-adénosine polymérase (PAP), pourrait être une approche valable pour inhiber ces parasites. L'un des principaux objectifs de la période restante sera l'étude de cette enzyme, pour laquelle nous disposons déjà de constructions d'ADN produisant des protéines bien adaptées aux études biophysiques et structurelles. Nous avons également lancé des méthodes informatiques de découverte des inhibiteurs basées sur la structure pour l'identification d'inhibiteurs présumés de la PAP.

1. Swale et al. Metal-captured inhibition of pre-mRNA processing activity by CPSF3 controls Cryptosporidium infection. Science Trans. Medicine 2019 Nov 6;11(517):eaax7161. doi: 10.1126.

2. Lukarska, M. & Palencia, A. Aminoacyl-tRNA synthetases as drug targets. The Enzymes, Elsevier. vol 48:321-350 (2020).

Les traitements actuels anti-toxoplasmose présentent encore une toxicité, une faible efficacité et des problèmes d’administration. La propagation de la résistance de Plasmodium à l'artémisinine est un problème majeur de santé. Cela met en évidence le besoin désespéré de nouvelles classes de médicaments, idéalement dirigés vers de nouvelles cibles, qui permettront de développer la prochaine génération d'agents antiparasitaires. Les Benzoxaboroles sont de nouveaux composés à base de bore qui ont acquis un grand intérêt thérapeutique, notamment avec la découverte de Kerydin, un antifongique approuvé par la FDA qui inhibe la leucyl-tRNA synthétase (LeuRS). J'étudierai ici le potentiel de ces nouveaux composés du bore pour traiter les infections causées par les parasites apicomplexes. Nous avons récemment identifié deux nouveaux Benzoxaboroles avec une bonne activité contre les parasites responsables de la toxoplasmose et le paludisme. Le premier, AN6426, pourrait inhiber la LeuRS mais son modus operandi reste inconnu. Le deuxième, AN3661, qu’a non seulement une très forte activité in vitro mais aussi une excellente efficacité in vivo pour guérir des souris de la toxoplasmose et du paludisme, étonnamment semble inhiber une cible sans précédent («Cleavage and Polyadenylation Specific Factor 3» ou CPSF3). Dans ce projet, j’utiliserai une approche multidisciplinaire pour valider les cibles moléculaires et étudier le mécanisme d’action de ces composés prometteurs. Il est important de noter que nous allons également tester des nouvelles séries de Benzoxaborole qui pourraient mener à la découverte de nouvelles cibles parasitaires et à la caractérisation structurale de nouveaux mécanismes d'inhibition.