Procédé vert de décontamination microbienne par la maîtrise de la lumière et de l’humidité – GreenDeconta

Identifier les longueurs d’onde les plus « antimicrobiennes » et comprendre le type de dommages cellulaires engendrés par un traitement lumineux à haute puissance à ces longueurs d’onde étaient les enjeux principaux du projet GreenDeconta. Les premières expérimentations ont consisté à rechercher les longueurs d’onde du spectre visible présentant l’effet le plus létal sur les microorganismes. Ces expérimentations ont permis d’identifier les longueurs d’onde associées à la lumière bleue comme les plus efficaces. Sur la base de ces résultats, un réacteur composé de deux séries de LED émettant aux longueurs d’onde 385 nm et 405 nm a été développé. Une disposition spécifique de LED a permis de générer une haute puissance lumineuse de 5000 W/m² par longueur d’onde. L’impact de l’humidité de l’air sur l’inactivation des microorganismes a également été évalué en plaçant le réacteur dans une chambre climatique à hygrométrie régulée. Après avoir caractérisé l’efficacité d’inactivation d’une lumière bleue à haute puissance en termes de temps et d’énergie consommée, les mécanismes cellulaires d’inactivation ont été recherchés. La photo-oxydation est le mécanisme central de l’inactivation photodynamique décrit jusqu’à maintenant dans la littérature. L’utilisation d’une forte puissance lumineuse pourrait cependant induire des dommages complémentaires. La microscopie et la cytométrie en flux ont été utilisées pour caractériser la génération intracellulaire d’espèces réactives dérivées de l’oxygène (ERO) et la perméabilisation membranaire. La levure modèle S. cerevisiae ainsi que certains mutants ont permis d’identifier des réponses cellulaires ainsi que des systèmes enzymatiques impliqués dans la résistance à un traitement lumineux. Le potentiel d’un traitement à haute puissance sur une chaîne industrielle a été évalué à l’échelle de laboratoire par le traitement de matériaux de surface (contamination par S. cerevisiae) ou de produits finis (pommes infectées par des spores de P. digitatum).

Les résultats issus du projet ont permis d’identifier les longueurs d’onde autour de 400 nm étaient les plus létales pour l’ensemble des microorganismes testés (S. cerevisiae, P. digitatum, B. cereus). Sur la base du potentiel de cette connaissance, un réacteur haute puissance à base de LED a été développé et utilisé afin d’effectuer des traitements rapides. Ce réacteur a permis de traiter des échantillons à 385 et/ou 405 nm à des puissances allant jusqu’à 5000 W/m² pour chaque longueur d’onde. Ce prototype a montré des résultats très convaincants sur les espèces végétatives avec des réductions de l’ordre plusieurs log, mais également une réduction de la population de spores de B. cereus sur des temps de l’ordre de la minute. L’étude de l’application simultanée des deux longueurs d’onde n’a pas révélé d’effets synergiques. Cela a tout de même permis de préciser que la longueur d’onde 385 nm était plus efficace que celle de 405 nm. Les mécanismes cellulaires conduisant à la mort des microorganismes suite à des traitements à 385 et 405 nm ont été ensuite étudiées sur la levure S. cerevisiae. Par une approche cytométrique, il a pu être montré que ces traitements lumineux induisent une production importante d’espèces réactives de l’oxygène. Cette production est plus importante à 385 nm qu’à 405 nm. Ceci explique la plus grande efficacité de la longueur d’onde la plus faible. L’effet des longueurs d’onde est également observé sur la perte d’intégrité de la membrane avec une perméabilisation plus importante à 385 nm. L’utilisation de souches de levures mutantes délétées pour des enzymes impliquées dans des systèmes de défense contre l’oxydation a confirmé le rôle de la photo-oxydation dans l’apparition de la mort des cellules. Cependant, la corrélation entre la perte de cultivabilité et la perte d’intégrité de la membrane plasmique n’est pas totale. Les expériences ont également démontré que le retrait de l’oxygène lors du traitement conduit à la mort des cellules mais dans une moindre mesure. Ceci suggère que d’autres mécanismes non liés à l’oxydation sont mis en jeu dans l’inactivation par la lumière. Beaucoup de contaminations microbiennes sont liées à des microorganismes interfaciaux présents à la surface d’aliments ou de surfaces technologiques. La résistance de microorganismes interfaciaux a finalement été étudiée après dépôt de levures sur des coupons représentatifs de surfaces technologiques. Des traitements très courts (moins de 5 min) ont permis une élimination complète de S. cerevisiae sur l’ensemble des surfaces traitées. Pour des traitements plus courts, il a cependant été montré que les taux d’inactivation dépendaient de la nature de la surface. Par exemple, un traitement de 2 min sur inox conduit à une inactivation d’environ 4 log alors qu’1,5 log est détruit sur le verre dans les mêmes conditions. Ces différences s’expliquent par les caractéristiques des surfaces telles que l’absorption et la réflexion du rayonnement lumineux.

D’un point de vue fondamental, les connaissances acquises lors du projet GreenDeconta ont permis de mieux comprendre les effets cellulaires de la lumière visible à haute intensité sur les microorganismes. Les avancées réalisées ont permis de mettre en évidence des effets létaux qui ne seraient pas exclusivement liés à la photo-oxydation. Ces mécanismes devront être recherchés pour décrire plus précisément le scénario des événements conduisant à la mort cellulaire lors de ces traitements. Cette connaissance pourrait permettre d'optimiser ce type de traitement de manière raisonnée. Les résultats issus du projet ont également mis en évidence un potentiel applicatif des traitements lumineux à haute puissance par des LED pour la décontamination de surfaces. Les surfaces technologiques alimentaires pourraient être traitées mais ces traitements pourraient également être appliqué sur des surfaces d’autres environnements (lieux publics, milieu hospitalier…) Enfin, les résultats du projet GreenDeconta ont conduit aux financements de 3 nouveaux projets autour de cette thématique. Le premier est le projet FEDER Virolux (2020-2021) dans lequel l’effet des traitements développés est étudié sur le Norovirus à l’origine des gastro-entérites virales. Le second concerne le projet ANR ClostAbat (2022-2026) dans lequel une des tâches est dédiée à la décontamination de surfaces contaminées par des bactéries pathogènes telles que Clostridium dans les abattoirs. Le dernier est un projet Inter-Carnot Qualiment/Plant2Pro (Effinox, 2022-2025) dans lequel seront étudiés les effets des traitements lumineux sur des matrices alimentaires des filières viti-vinicoles et céréalières.

A l’issue de ce projet, un article scientifique a été accepté pour publication dans Applied Microbiology and Biotechnology et deux autres articles originaux sont en cours de finalisation. Le premier article concerne le développement du réacteur Ultra Haute Intensité (UHI) et la preuve d’efficacité sur des surfaces technologiques. Le deuxième s’attache à décrire l’efficacité sur des formes plus résistantes (spores bactériennes et fongiques). Le dernier article décrit les mécanismes cellulaires associés à l’inactivation microbienne par la lumière intense.

1. Lang E., Thery T., Peltier C., Colliau F., Adamuz J., Grangeteau C., Dupont S., Beney L. Ultra-High Irradiance (UHI) blue light: Highlighting the potential of a novel LED-based device for short antifungal treatments of food contact surfaces, Applied Microbiology and Biotechnology (In press, doi.org/10.1007/s00253-021-11718-9)
2. Thery T., Grangeteau C., Beney L., Dupont S. Ultra-High Irradiance (UHI) LED inactivation of bacterial and fungal spores (en cours de finalisation, soumission dans Food Control prévue premier semestre 2022)
3. Thery T., Grangeteau C., Beney L., Dupont S. Ultra-high irradiance blue light treatment : kinetics and mechanisms of inactivation (en cours de finalisation, soumission dans Frontiers in Microbiology prévue premier semestre 2022)

En plus de pouvoir présenter certains effets pathogènes, la présence de microorganismes à la surface des matières premières alimentaires est à l’origine d’une perte importante de la production agricole destinée à la consommation. La principale solution actuelle est l’emploi massif de fongicides et bactéricides utilisés directement sur les fruits et légumes, sur les surfaces technologiques ou bien encore pour traiter les eaux de lavage des matières premières agricoles. Cette solution induit cependant des problèmes environnementaux et toxicologiques majeurs. De ce fait, la recherche de solutions ou technologies alternatives durables est devenu un enjeu majeur.
Le projet GreenDeconta propose de développer des connaissances sur la réponse de microorganismes (bactéries et champignons) et sur les dommages cellulaires induits par l’exposition à certaines longueurs d’onde de la lumière visible (photo-oxydation). Ces connaissances pourraient être utilisées pour développer un procédé raisonné et durable d’inactivation des flores microbiologiques pathogènes et d’altération. Les microorganismes étudiés dans le projet seront des bactéries (E. coli et B. cereus) et des champignons (S. cerevisiae et P. digitatum). Pour les microorganismes pouvant former des spores, la résistance aux traitements lumineux des formes végétatives sera comparée à celle des spores. Le projet GreenDeconta est divisé en trois « work packages » (WP) qui permettront, in fine, d’identifier le potentiel applicatif d’une telle technologie. Le WP1 concerne l’identification des longueurs d’onde de la lumière visible affectant la viabilité des microorganismes ainsi que la caractérisation des effets cellulaires pour chacune d’entre elles. A l’issue de ce WP, un réacteur lumineux utilisant la technologie LED sera développé afin de pouvoir traiter des échantillons avec plusieurs longueurs d’onde simultanément. Le WP2 intégrera l’humidité relative de l’air comme paramètre contrôlable lors d’un traitement lumineux. Ce paramètre pourrait augmenter l’effet décontaminant des traitements lumineux. D’une part, une diminution de l’humidité de l’air peut affecter la physiologie des microorganismes, et notamment leur résistance aux perturbations. D’autre part, la diminution de la quantité de vapeur d’eau dans l’air, qui diminue la diffusion de la lumière entre la source et les échantillons, pourrait permettre un traitement plus efficace des échantillons. Dans le WP3, l’inactivation des différents microorganismes du projet sera modélisée. Pour cela, les courbes d’inactivations de ces microorganismes obtenues dans différentes conditions (dans un milieu liquide et à l’interface sur des supports inertes ou sur des fruits) seront traitées à l’aide de modèles linéaires et non-linéaires. Le modèle présentant un ajustement optimal par rapport aux données expérimentales sera retenu. Ces informations seront particulièrement intéressantes pour identifier les champs d’application possibles des traitements lumineux basés sur la combinaison de plusieurs longueurs d’onde de la lumière visible. Enfin, des essais préliminaires seront effectués sur des fruits (pommes et citrons) qui auront été préalablement inoculés avec différents microorganismes.
Ce projet développera des connaissances sur la réponse et la résistance des microorganismes à la photo-oxydation induite par la lumière visible. D’une manière originale, les structures cellulaires affectées en fonction des longueurs d’onde utilisées seront identifiées. Ces connaissances permettront de développer un réacteur LED combinant différentes longueurs d’onde de la lumière visible. L’impact de la maîtrise de l’humidité relative sur l’efficacité du procédé développé sera caractérisé. Les résultats obtenus permettront au Jeune Chercheur coordinateur du projet de développer une nouvelle thématique de recherche au sein de son laboratoire. Ils seront également la base du futur développement d’un procédé durable de décontamination microbienne.