Analyse multi-échelle des mécanismes précoces de remodelage de la chromatine au niveau des dommages dans l'ADN – REPAIRCHROM

Dans le cadre de ce projet, deux approches seront utilisées pour induire des dommages dans l'ADN en cellules vivantes : la micro-irradiation laser et l'induction de l'activité de coupure d'enzymes de restriction. Ces deux approches sont complémentaires: la première permettant de contrôler précisèment l'instant d'induction des dommages et donc le démarrage de la réponse cellulaire au dommage et la seconde étant capable d'induire des dommages au niveau de loci prédéfinis du génome. La mise en parallèle des résultats obtenus via les deux approches permettra de combiner les avantages de ces deux méthodes. L'analyse multiéchelle des remodelages de la chromatine associés à l'activation de la réponse cellulaire aux dommages impliquera d'associer plusieurs techniques complémentaires. La dynamique à l'échelle nucléosomale sera caractérisée en combinant des approches d'ATAC-seq avec des méthodologies d'imagerie de molécule unique : spectroscopie de corrélation de fluorescence et suivi de molécules uniques. Aux niveaux supérieurs, la dynamique des boucles de chromatine et des TAD sera suivie par capture de conformation de chromatine (4C-seq) et par suivi des mouvements des TAD au sein du noyaux des cellules vivantes. Ces différentes approches seront utilisées pour analyser les changements affectant la structure chromatinienne au niveau de cassures dans l'ADN induites par irradiation laser ou par enzyme de restriction et pour identifier le role spécifique de différents remodeleurs chromatiniens dans ces processus. Par ailleurs, afin de mieux comprendre la manière dont ces remodeleurs affectent la balance entre HR et NHEJ, nous étudierons comment ceux-ci régulent le processus de résection de l'ADN au niveau des cassures double-brins. En effet, le choix entre l'initiation de ce processus ou son blocage détermine si la cassure va ensuite être réparée par HR ou NHEJ.

A ce stade du projet, les différentes méthodes pour étudier la structure chromatinienne au niveau des zones de dommages sont fonctionnelles ou en passe de l'être. En particulier, la mise en place d'un module d'irradiation laser sur le système de microscopie de molécule unique développé dans l'équipe de J. Miné Hattab va permettre de suivre à l'échelle de la molécule individuelle et en cellules vivantes la dynamique des nucléosomes et de protéines de réparation après induction de dommages par micro-irradiation. Par ailleurs, les méthodologies fondées sur la spectroscopie de corrélation de fluorescence pour étudier les déplacements locaux des nucléosomes et la dynamique d'échange des protéines de réparation au niveau des dommages ont permis d'obtenir de premiers résultats notamment sur la dynamique d'association/dissociation de PARP1 sur les lesions. Enfin, les approches génomiques d'analyse de la structure chromatinienne (ATAC-seq, HiC) ont aussi été utilisées pour mettre en évidence différents changements de structure chromatinienne à proximité des cassures mais aussi de proposer un nouveau mécanisme de mise en place des foci de réparation impliquant le processus d'extrusion de boucles d'ADN (Arnould et al., bioRxiv, 2020). Par ailleurs, le rôle fonctionnel du remodeleur chromatinien Alc1 a aussi été étudié en détails et il a pu être montré que ce remodeleur est essentiel pour une dissociation efficace de PARP1 des dommages, un processus nécessaire pour la poursuite de la réparation à la fois par HR et NHEJ.

A présent que les différentes méthodologies d'analyse de la structure chromatinienne au niveau des dommages sont fonctionnelles ou en passe de l'être, nous allons pouvoir analyser l'impact spécifiques de différents remodeleurs sur les réorganisations subies par la chromatine en réponse à l'activation de la réponse cellulaire aux dommages. En analysant en parallèle l'impact de ces remodeleurs sur les étapes suivantes du processus de réparation, nous serons en mesure de mieux appréhender la manière dont l'architecture chromatinienne influence l'efficacité des processus de réparation. En permettant de progresser dans la compréhension des fonctions de la voie signalisation par PARylation lors de la réparation de l'ADN, notre projet pourrait aussi contribuer à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour certains traitements anti-cancéreux. Par ailleurs, l'architecture chromatinienne étant perturbée dans la majorité des cellules tumorales, notre projet permettra de mieux définir l'impact de ces perturbations sur l'efficacité des processus de réparation de l'ADN dans ces cellules.

1. Single molecule microscopy reveals key physical features of repair foci in living cells, J. Miné-Hattab, M. Heltberg, M. Villemeur, C. Guedj, T. Mora, A. M. Walczak, M. Dahan, A. Taddei, BioRxiv, submitted, 2020
2. Complex chromatin motions for DNA repair, J. Miné-Hattab*, I. Chiolo*, accepted in Frontiers in Genetics, 2020 (*co-corresponding authors)
3. Loop extrusion as a mechanism for DNA Double-Strand Breaks repair foci formation. C. Arnould, V. Rocher, T. Clouaire, P. Caron, P. E. Mangeot, E. P. Ricci, R. Mourad, D. Noordermeer, G. Legube, BioRxiv, submitted, 2020
4. The Secret Life of Chromosome Loops upon DNA Double Strand Break. C
Arnould and G. Legube. J Mol Biol. 2020 Feb 7;432(3):724-736. Review
5. The chromatin remodeler ALC1 underlies resistance to PARP inhibitor treatment, S. Juhász, R. Smith, T. Schauer, D. Spekhardt, H. Mamar, S. Zentout, C. Chapuis, S. Huet*, G. Timinszky*, submitted, 2020 (*co-corresponding authors)
6. CHD7 and 53BP1 regulate distinct pathways for the re-ligation of DNA double-strand breaks. M. B. Rother, S. Pellegrino, R. Smith, M. Gatti, C. Meisenberg, W.W. Wiegant, M. S. Luijsterburg, R. Imhof, J.A. Downs, A.C.O. Vertegaal, S. Huet, M. Altmeyer, H. van Attikum, submitted, 2020
7. Poly (ADP-ribose)-dependent chromatin unfolding facilitates the association of DNA-binding proteins with DNA at sites of damage, R. Smith, T. Lebeaupin, S. Juhász, C. Chapuis, O. D’Augustin, S. Dutertre, P. Burkovics, C. Biertümpfel, G. Timinszky*, S. Huet*, 2019. Nucleic Acids Research, 47(21):11250-11267 (*co-corresponding authors)

La réparation de l'ADN endommagé implique à des stades précoces un remodelage actif de la chromatine dont la fonction exacte reste mal définie mais qui semble essentiel à une restauration efficace des dommages. La voie de signalisation par poly-ADP-ribosylation (PARylation) et notamment, différents remodeleurs de la chromatine dépendants de cette voie, jouent un rôle central dans ces étapes de réorganisation de la chromatine liées à l'activation de la réponse cellulaire aux dommages dans l'ADN.
Dans ce projet, nous avons pour objectif non seulement de réaliser une description fine de ces processus de remodelage chromatinien mais aussi de mieux comprendre leur impact sur les étapes ultérieures de la réparation. Dans ce contexte, nous nous intéresserons plus particulièrement au rôle joué par les remodeleurs contrôlés par la PARylation. A cette fin, en combinant les expertises de trois équipes de recherche, nous proposons de mettre en place un protocole d'analyse multi-échelle permettant de caractériser les différents niveaux de structuration de la chromatine : de l'échelle du nucléosome à celui des domaines topologiques (TAD). La dynamique à l'échelle nucléosomale sera caractérisée en combinant des approches d'ATAC-seq avec des méthodologies d'imagerie de molécule unique : spectroscopie de corrélation de fluorescence et suivi de molécules uniques. Aux niveaux supérieurs, la dynamique des boucles de chromatine et des TAD sera suivie par capture de conformation de chromatine (4C-seq) et par suivi des mouvements des TAD au sein du noyaux des cellules vivantes. Ces différentes approches seront utilisées pour analyser les changements affectant la structure chromatinienne au niveau de cassures dans l'ADN induites par irradiation laser ou par enzyme de restriction. Par la suite, nous analyserons l'implication des remodeleurs de la chromatine dépendants de la PARylation dans ces changements de structure. Enfin, nous étudierons comment les réorganisations chromatiniennes spécifiques des remodeleurs étudiés influencent les étapes ultérieures de la réparation. Nous nous intéresserons notamment à la régulation du processus de résection de l'ADN au niveau des cassures double-brins. Le choix entre l'initiation de ce processus ou son blocage détermine en effet si la cassure va ensuite être réparée par recombinaison homologue (HR) ou par jonction d'extrémités non homologues (NHEJ). Nous analyserons ainsi l'impact de l'extinction par interférence ARN des différents remodeleurs sur le recrutement des protéines régulant l'initiation du phénomène de résection. Nous étudierons aussi comment cette extinction affecte la balance entre HR et NHEJ ainsi que l'efficacité et la fidélité du mécanisme de restauration de la zone endommagée. Il nous sera ainsi possible d'analyser la fonction spécifique des remodelages précoces de la chromatine dans les mécanismes de préservation de l'identité du génome.
En permettant de progresser dans la compréhension de l'influence de la voie de signalisation par PARylation sur le processus de réparation de l'ADN, notre projet pourrait contribuer à identifier de nouvelle cibles thérapeutiques pour certains traitements anti-cancéreux. Par ailleurs, l'architecture chromatinienne étant perturbée dans la majorité des cellules tumorales, notre projet permettra de mieux définir l'impact de ces perturbations sur l'efficacité des processus de réparation de l'ADN dans ces cellules.