Décodage de la réponse auxine à l'interface ARFs-chromatine – ChromAuxi

Ce travail a nécessité la mise en place d'un grand nombre de méthodes

1- Productions et purifications de protéines sauvage ou mutantes pour les analyses d’interaction ARF/ADN.

2- DAP-seq (DNA Affinity Purification sequencing) pour identifier les sites de liaison des ARFs sur l’ADN in vitro et caractériser leurs préférences pour différentes configurations d’AuxREs.

3- ChIP-seq (Chromatin Immuno Purification sequencing) pour identifier les sites de liaison des ARFs in vivo.

4-ATAC-seq (Assay for Transposase Accessible Chromatin) pour identifier les régions de chromatines ouvertes et fermées.

5- Bio-informatique pour l’analyse des données de séquençage massif issues des DAP-sec, ChIP-sec, ATACseq..., pour déterminer l'ensemble des AuxRE (Auxin Resonses Elements) liés par les ARFs sur le génome in vitro et in vivo. Pour évaluer la fréquence, le type et la topologie des paires d’AuxREs dans les promoteurs endogènes

6- EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay) pour confirmer in vitro l'affinité de liaison spécifique des ARFs à certaines paires d’AuxRE.

7- Construction de promoteurs synthétiques. Quatre promoteurs (3x-hIR8, 3x-hER13, 3x-hDR5, 3x-hDR15) ont été créés pour tester l’affinité de liaison des ARFs dans différents contextes.

8- Transfection de cellules animales (CHO-K1) pour tester la liaison et l'activité transcriptionnelle des ARFs en dehors du contexte végétal.

9- Transfection de protoplastes d’Arabidopsis pour observer la régulation transcriptionnelle des promoteurs synthétiques en réponse à l’auxine dans un système végétal.

10- Transformation stable d’Arabidopsis avec des promoteurs synthétiques couplés à des gènes rapporteurs (gène fluorescent) pour étudier la spécificité spatiale de l’expression en racine et la réponse à l’auxine.

11- Traitement hormonal (auxine) pour analyser l'induction des promoteurs synthétiques et l’effet sur l’expression des ARFs et de leurs cibles.

12- Analyse de mutants (mutations simples ou croisements mutants x reporteurs) pour valider les rôles fonctionnels des ARFs dans l’activation/répression des promoteurs et tester les prédictions de modèles.

13. Imagerie confocale (visualisation des reporters) pour observer les patrons d’expression des promoteurs synthétiques dans les tissus racinaires.

14. scRNA-seq (single-cell RNA sequencing) pour établir des profils d’expression des ARFs au niveau cellulaire, avec et sans traitement à l’auxine.

15. Modélisations (random forest) pour valider et prédire des interactions ARFs-reporters et révéler des combinaisons d’ARFs influençant l'expression.

Nous avons montré que les ARFs répartis en trois classes (A, B, C), montrent des préférences distinctes pour des configurations spécifiques d’AuxREs : répétitions inversées (IR), éversées (ER) et directes (DR). Les ARFs-A présentent une large capacité de liaison (IR7/8, ER12/13, DR4/5, DR14/15) (le chiffre indiqué apres IR, ER et DR représentant le nombre de nucléotides entre 2 AuxREs). Les ARFs-B se lient principalement aux IR7/8 et les ARFs-C, moins connus, notamment ARF10, ciblent préférentiellement ER13 et DR4, mais pas IR7. Ces préférences montrent que la structure du promoteur influence fortement le recrutement des ARFs, suggérant que les gènes cibles contenant des configurations spécifiques d’AuxREs pourraient recruter sélectivement certaines classes d’ARFs, induisant des effets transcriptionnels spécifiques.

À partir de ces observations, des promoteurs synthétiques contenant des motifs spécifiques (IR8, ER13, DR5, DR15) ont été construits et testés dans différents systèmes (cellules animales, protoplastes végétaux, racines d’Arabidopsis). Ces tests ont révélé une capacité variable des ARFs à activer la transcription, avec parfois des effets synergiques ou antagonistes selon les combinaisons d’ARFs exprimés. Il ont aussi montré une expression différentielle des promoteurs synthétiques en racine, malgré un même niveau global d’auxine.

Pour affiner cette compréhension, une analyse transcriptomique en cellule unique (scRNA-seq) a été menée sur des racines exprimant ces promoteurs. Cela a permis d’une part de cartographier les ARFs exprimés par cellule et de relier leur expression à des motifs transcriptionnels spécifiques (IR8, ER13, DR5) et d’autre part de construire des réseaux de co-expression et de régulation, validés par modélisation et machine learning.

L’ensemble de nos données soutient un modèle à deux niveaux pour expliquer la diversité des réponses à l’auxine :

-Niveau 1 : la combinaison des ARFs exprimés dans chaque cellule (activateurs/répresseurs).

-Niveau 2 : la configuration des AuxREs dans les promoteurs cibles, déterminant l’accessibilité des ARFs.

Ce modèle permet de comprendre la non-linéarité de la réponse transcriptionnelle à un signal unique, et met en lumière les limites de l’usage du seul promoteur DR5 pour suivre les effets de l’auxine. Les nouveaux promoteurs synthétiques élargissent ainsi considérablement la capacité à étudier et visualiser les réponses à l’auxine dans des contextes cellulaires spécifiques.

En marge de cette étude, nous avons cherché à comprendre comment la voie de signalisation auxine s'était mis en place au cours de l'évolution. Nous avons montré que les ARFs dérivent d’un ARF ancestral de type C, déjà fonctionnel chez les algues charophytes, et que la signalisation à l’auxine est apparue par ajout d’un système de perception hormonale au moment de l'apparition des plantes terrestres.

Ces outils ouvrent la voie à une meilleure compréhension des réponses développementales contrôlées par l’auxine, et la conception de circuits transcriptionnels artificiels pour l’ingénierie végétale de précision.

Le projet ChromAuxi vise à comprendre comment l'interaction entre les Facteurs de Réponse à l’Auxine (ARF) et la dynamique chromatinienne orchestre la multiplicité des réponses transcriptionnelles à cette phytohormone chez Arabidopsis. Dans ce but nous déterminerons les règles de liaison des différentes classes d’ARF sur l'ADN génomique et caractériserons leur interaction avec des protéines affectant l’organisation chromatinienne. Nous déterminerons ensuite comment le contexte chromatinien influence la liaison des ARFs le long du génome et comment cette liaison modifie l'accessibilité de la chromatine en réponse à l'auxine. L’importance des règles moléculaires ainsi établies sera testée in planta à l’aide de méthodes d’ingénierie de l’(épi)génome. Ce décryptage de la réponse auxinique à l’interface ARF-chromatine devrait révéler les principes fondamentaux qui régissent les nombreuses et spécifiques régulations déclenchées par l’auxine au cours du développement des plantes.