CE11 - Caractérisation des structures et relations structure-fonctions des macromolécules biologiques

Mécanisme moléculaire de transcription par la polymérase du virus de la grippe – FluTranscript

Mécanisme moléculaire de transcription par la polymérase du virus de la grippe

Les virus grippaux représentent une menace permanente pour la santé publique mondiale en raison de la morbidité qu'ils provoquent, de leur grande transmissibilité et de l’imprévisibilité de leur évolution. L'ARN polymérase ARN-dépendante du virus (FluPol) effectue la transcription et la réplication du génome viral constitué d’ARN segmenté. Une meilleure compréhension des mécanismes de la transcription peut à terme favoriser le développement d’une nouvelle génération de médicaments antigrippaux.

Une compréhension fine des mécanismes moléculaires qui sous-tendent la synthèse d’ARN messagers par la polymérase des virus influenza.

L'objectif global de FluTranscript est de fournir une description mécanistique détaillée et intégrée de la transcription virale in vitro et dans le contexte cellulaire. Pour atteindre cet objectif ambitieux, les groupes de Cusack et de Naffakh combineront leurs expertises complémentaires en biologie structurale et en virologie moléculaire, respectivement. Les résultats attendus sont des instantanés structuraux correspondant aux étapes clés de la transcription par l'ARN polymérase virale hétérotrimérique, de nouvelles informations sur le site actif de la de la sous-unité PB1 de la polymérase pouvant être exploités pour la conception de nouveaux médicaments antigrippaux, la caractérisation structurale et fonctionnelle de l'interaction entre FluPol, Pol II et d'autres facteurs de la cellule hôte liés à la transcription, et l'analyse de la composition des mRNPs virales, potentiellement distincte de celle des mRNPs cellulaires.

Méthodes de biologie structurale comprenant la production de polymérase recombinante et la reconstitution avec des ARN viraux modèles, biochimie, biophysique, détermination de la structure par cristallographie aux rayons X et microscopie cryo-électronique.
Virologie moléculaire et cellulaire, système de minigénomes influenza, virus influenza sauvages ou mutés produits par génétique inverse avec des virus. Méthodes protéomiques pour identifier les protéines de l'hôte impliquées dans la transcription virale.

Résultats
Le principal résultat du projet FluTranscript à ce jour est l'élucidation du mécanisme détaillé de la transcription par la polymérase du virus influenza. En utilisant la cryo-microscopie électronique à haute résolution, nous avons visualisé la dynamique conformationnelle de la polymérase au cours du cycle complet de transcription, de la pré-initiation à la terminaison, en nous concentrant sur la trajectoire de l’ARN matrice. Après avoir été copiée et après être sortie de la cavité du site actif, l'extrémité 3' de l’ARN matrice se fixe sur un site spécifique à la surface de la polymérase. Là elle reste séquestrée pendant toutes les étapes de transcription suivantes, ce qui oblige la matrice à faire une boucle au fur et à mesure de sa translocation. Lors de la terminaison, la contrainte stérique entre l'extrémité 5' de la matrice fixée à la polymérase et le site actif entraîne une polyadénylation par bégaiement au niveau de l'uridine 17. Lors de la dissociation du produit de transcription, d'autres changements de conformation libèrent la matrice, permettant un retour de la RNP à l'état de pré-inititiation. La polymérase des virus influenza effectue donc la transcription tout fxant étroitement les deux extrémités de l’ARN matrice et en les protégeant, ce qui permet la production efficace de plusieurs ARNm à partir d'une seule RNP.

Les travaux en cours ont pour objectif d’élucider comment la polymérase des virus influenza interagit avec l’ARN polymérase II cellulaire au cours du processus de capture de coiffe au début de la transcription, et d’identifier la composition des mRNPs virales.

1. A Structure-Based Model for the Complete Transcription Cycle of Influenza Polymerase. Wandzik JM, Kouba T, Karuppasamy M, Pflug A, Drncova P, Provaznik J, Azevedo N, Cusack S. Cell. 2020, 181(4):877-893.e21. PMID: 32304664.
2. Structural snapshots of actively transcribing influenza polymerase. Kouba T, Drncová P, Cusack S. Nat Struct Mol Biol. 2019, 26(6):460-470. PMID:31160782
3. Structure and Function of Influenza Polymerase. Wandzik JM, Kouba T, Cusack S. Cold Spring Harb Perspect Med. 2020 Apr 27:a038372. doi: 10.1101/cshperspect.a038372. Online ahead of print. PMID: 32341065
4. Influenza Virus RNA-Dependent RNA Polymerase and the Host Transcriptional Apparatus. Tim Krischuns, Maria Lukarska, Nadia Naffakh and Stephen Cusack. Annual Review of Biochemistry 2021:90 (In press).
5. Patent application: NUCLEIC ACID CONSTRUCT BINDING TO INFLUENZA POLYMERASE PB1 RNA SYNTHESIS ACTIVE SITE. Publication number: WO/2020/239822. Publication date: 03.12.2020.

Les virus influenza représentent une menace grave et globale pour la santé publique. L’amélioration des mesures de prévention et de thérapie, qu'il s'agisse d’un vaccin universel ou de nouveaux médicaments anti-influenza, reposera largement sur les recherches fondamentales visant à mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la réplication et la transmission virales. Dans FluTranscript, nous nous focalisons sur le mécanisme original par lequel l'ARN polymérase ARN-dépendante des virus influenza (FluPol) synthétise les ARNm viraux dans le noyau de la cellule infectée. FluPol se lie directement à la l’ARN polymérase II cellulaire (Pol II), ce qui lui permet de détourner des transcrits coiffés naissants et de les utiliser comme amorces de la synthèse de l'ARNm viral, un processus connu sous le nom de «vol de coiffe». Une queue poly(A) est ajoutée au transcrit viral par le bégaiement de FluPol sur un motif oligo-U situé à l’extrémité 5’ de la matrice génomique, court-circuitant ainsi la machinerie cellulaire de polyadénylation. Le but du projet FluTranscript est de fournir une description mécanistique détaillée de la transcription virale in vitro et dans le contexte cellulaire. Cet objectif sera atteint en associant les expertises complémentaires en biologie structurale et en virologie moléculaire de deux partenaires, qui sont tous deux des leaders dans le domaine de la recherche sur les virus influenza. En utilisant de la cristallographie aux rayons X et de la cryo-microscopie électronique de pointe, nous déterminerons la structure qu’adopte FluPol à chaque étape clé de la transcription, incluant l'initiation, l'élongation et la terminaison. Nous déterminerons également des structures dans lesquelles des inhibiteurs de la synthèse d'ARN, tels que des analogues de nucléosides, sont liés au site actif de FluPol, fournissant ainsi des données indispensables à la conception de nouvelles molécules antivirales plus performantes. En complément de ces études in vitro, nous chercherons à comprendre comment, dans le contexte cellulaire, FluPol interagit avec Pol II et d'autres facteurs liés à la transcription pour accéder aux transcrits coiffés de Pol II. Nous purifierons des complexes de « vol de coiffe » à partir de lysats de cellules infectées afin d'identifier les facteurs impliqués, et nous utiliserons ces données afin de reconstituer le complexe constitué des deux polymérases Pol II-FluPol pour des études structurales par cryo-microscopie électronique. Enfin, en utilisant des méthodes de pontage ARN-protéine et de protéomique, nous caractériserons l'interactome des ARNm viraux, afin de déterminer dans quelle mesure le procédé particulier de synthèse des ARNm viraux affecte la composition des ribonucléoprotéines messagères (mRNPs) virales. La validation croisée entre les données structurales obtenues in vitro et les données virologiques obtenues en contexte cellulaire sera un élément essentiel du projet. Les résultats attendus de FluTranscript révèleront de nouveaux aspects du fonctionnement de la machinerie de réplication/transcription des virus influenza et ouvriront la voie au développement de médicaments anti-influenza de nouvelle génération.

Coordination du projet

Stephen CUSACK (European Molecular Biology Laboratory)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

IP Paris INSTITUT PASTEUR
EMBL Grenoble European Molecular Biology Laboratory

Aide de l'ANR 447 495 euros
Début et durée du projet scientifique : décembre 2018 - 36 Mois

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