Caractérisation, in vitro, de la régulation des moteurs moléculaires et de l’organisation des microtubules par les protéines du transport Intra-flagellaire. – IRMM

Objectif 1. Caractérisation des interactions IFT-MTs et de leur impact sur la dynamique et l'organisation des MTs.
1a- Comment les IFTs interagissent-elles avec les MTs?
Nous proposons d'utiliser des complexes IFTs de différentes compositions et d’étudier leurs interactions avec des MTs stabilisés via des expériences de co-sédimentation. Ensuite, à l'aide de la microscopie TIRF, nous caractériserons précisément la capacité de ces sous-complexes IFT à interagir avec des MTs stabilisés ou dynamiques (Figure 1).
1b- Les IFTs affectent-elles la dynamique et l'organisation MT?
Nous allons d'abord évaluer la capacité des sous-complexes IFTs à moduler la dynamique des MTs. Ensuite, nous étudierons leurs effets sur l'auto-organisation de structures de MTs telles que les faisceaux et les croisements de MTs (Figure 1).

Objectif 2- Caractérisation des interactions IFT-moteurs et de leur impact sur l'organisation des MTs.
Nous nous intéressons ici à deux kinésines qui interagissent avec les IFTs: Mklp2 et HSET / KifC1.
2a- Comment les IFTs interagissent-elles avec les moteurs liés aux MTs et ont-elles un impact sur leur activité motrice? Nous allons d'abord valider l'interaction IFT-moteurs, en utilisant des protéines purifiées, en procédant à des expériences de co-sédimentation. Ensuite, les complexes IFTs seront utilisés pour cartographier plus finement les zones d' interactions. Pour évaluer l'impact des IFTs sur l'activité motrice, nous étudierons par microscopie TIRF le comportement des kinésines sur des MTs stabilisés en présence de divers sous-complexes (Figure 1).
2b- Comment les complexes IFT-Moteurs impactent l'organisation des MTs? Pour répondre à cette question, nous ajouterons des complexes IFT-moteurs à des MTs dynamiques et nous évaluerons, d'une part, leur capacité à moduler la dynamique des MTs et, d'autre part, leurs effets sur le regroupement et le croisement des MTs (Figure 1).

Nous avons démontré une interaction directe entre la Kinesin HSET et un sous-complexe constitué d'IFT88/70/52/46 en utilisant des IFTs recombinantes purifié provenant de l'organisme Chlamydomonas Reinhardtii. Ce résultat fait partie d'une étude plus large récemment publiée qui montre l'importance des protéines IFTs, en association avec kinésine HSET, pour l'agrégation des centrosomes surnuméraires dans les cellules cancéreuses,: Vitre, B., Taulet, N., Guesdon, A., Douanier, A., Dosdane, A., Cisneros, M., et al. (2020). IFT proteins interact with HSET to promote supernumerary centrosome clustering in mitosis . EMBO Reports Vol. 59, pp.9-15. doi:10.15252/embr.201949234.

Nous avons exprimé et purifié, à partir de cellules d'insectes, les protéines IFT88/ 70/ 52/ 46 recombinantes d'origine humaine, exprimées individuellement ou en sous-complexes. Nous avons marqué ces protéines avec des marqueurs fluorescents et nous avons commencé à étudier leurs interactions in vitro avec la kinésine HSET en utilisant la microscopie TIRF.

Nous avons identifié une interaction directe entre le sous-complexe IFT88 / 70/52/46 et la kinesine HSET et nous avons montré son son importance pour l'agrégation des centrosomes surnuméraires dans les cellules cancéreuses.
Nous allons maintenant caractériser les interactions entre les protéines recombinantes d'origine humaine IFT88/70/52/46 et la tubuline et/ou les microtubules ainsi que leurs interactions avec la kinésine HSET en utilisant la microscopie TIRF. Cette caractérisation qui correspond à l'objectif 1 et à une partie de l'objectif 2 du projet devrait être réalisée dans les 12 prochains mois du projet.

Nous avons publié un article original dans EMBO reports:
Vitre, B., Taulet, N., Guesdon, A., Douanier, A., Dosdane, A., Cisneros, M., et al. (2020). IFT proteins interact with HSET to promote supernumerary centrosome clustering in mitosis . EMBO Reports Vol. 59, pp.9-15. doi:10.15252/embr.201949234.

Au cours du cycle cellulaire, le cytosquelette de MTs est constamment remodelé permettant ainsi le bon déroulement de divers processus cellulaires. Cette réorganisation des MTs s’effectue via des interactions avec des protéines associées aux MTs (MAPs) et/ou des moteurs moléculaires associés aux MTs comme la dynéine ou les kinésines. L’objectif de ce projet est de comprendre comment les protéines du transport intraflagellaire (IFTs), qui ont été récemment montrée comme ayant des fonctions à la fois ciliaires et non ciliaires, à diffèrents stades du cycle cellulaire, peuvent réguler l’activité et l’organisation des microtubules (MTs) et des moteurs qui leur sont associés. En effet,

En effet, les protéines de la machine de transport intraflagellar (IFT) appartiennent à des complexes de transport polarisés qui fonctionnent en association avec des MTs et des moteurs. Elles ont initialement été décrites pour leur rôle dans les cils et leur implication dans la polykystose rénale. Cependant, plusieurs travaux visant à caractériser les fonctions de l'IFT dans des systèmes cellulaires et in vivo, et notamment des études du laboratoire, indiquent que les IFTs ont également des fonctions non ciliaires. En effet, ces études montrent que les IFTs peuvent interagir avec les MTs et des moteurs moléculaires cytoplasmique, tels que la dynéine cytoplasmique et la kinésine Mklp2, et ont un effet sur la régulation de la dynamique des MTs et donc sur l’organisation du cytosquelette. Ces résultats indiquent donc de nouvelles fonctions régulatrices par les IFTs de la dynamique du cytosquelette et il est donc important de comprendre en détails la nature de ces régulations.

Afin de s’affranchir de la complexité inhérente au milieu intracellulaire, nous proposons ici, d’utiliser une approche in vitro avec des protéines purifiées couplées à de la microscopie TIRF, afin de caractériser, au niveau moléculaire, les interactions IFT-MTs-moteurs et leur influence sur la dynamique et l'organisation des MTs. Plus précisément, nous proposons (OBJECTIF 1) de caractériser l’interaction de sous-complexes constitués d’un nombre variables de protéines IFT avec les MTs ainsi que leur impact sur la dynamique individuelle des MTs et sur l’assemblage de structures composées de multiples MTs. Nous focaliserons principalement notre étude sur des sous complexes IFT précédemment décrits et purifiés par notre collaborateur et qui contiennent IFT88 dont nous savons qu’elle participe à des fonctions non-ciliaires. Nous étudierons également (OBJECTIF 2) comment ces différents complexes d’IFTs peuvent réguler l’activité motrice des kinésines Mklp2 et HSET qui sont essentielle à la division cellulaire et dont nous savons, grâce à des études récemment publiée, et en cours au laboratoire, qu’elles interagissent avec des IFTs in vitro ainsi que dans le contexte cellulaire.

Ce travail in vitro permettra de réduire la complexité moléculaire de la machinerie de transport intraflagellaire et permettra de mieux comprendre les interactions moléculaires complexes entre les IFTs, les moteurs et les MTs qui se produisent à différentes étapes du cycle cellulaire dans un contexte cellulaire. Cette étude permettra donc une compréhension moléculaire précise de ces interactions complexes et viendra compléter le travail actuellement effectué dans l'équipe pour comprendre les fonctions de l'IFT dans un contexte cellulaire et in vivo. Etant donné que MKLP2 et HSET ont été proposées comme étant des cibles intéressantes pour le traitement des cancers, ce travail pourrait, à terme, permettre le développement de molécules ciblant leur activité.