CE11 - Caractérisation des structures et relations structure-fonctions des macromolécules biologiques

Stabilisateurs moléculaires des protéines membranaires pour leur étude structurale en solution – CLAMP2

Résumé de soumission

Les protéines membranaires (PMs) représentent 25 à 30% des protéomes. Leur rôle clé dans la signalisation et le transport en font la cible de 70% des médicaments actuels et de 80% des prochains (estimé). Connaître leur structure 3D à l’échelle atomique est nécessaire pour concevoir les meilleurs médicaments. Il faut pour cela les extraire de leur environnement lipidique natif puis les purifier en solution aqueuse. Les détergents sont des acteurs clés de ce processus mais, plus échangeables que les lipides, ils stabilisent moins efficacement la structure native des PMs. De fait, la structure des PMs ne représente que 2% de l’ensemble des protéines.
Pour faire face à ce problème, les partenaires français, P1 et P2, ont développé des Clamps, détergents caractérisés par une capacité d'interaction renforcée avec les PMs. Parmi eux, une série de détergents dicarboxylate-osides, DCODs, a permis d’augmenter de 20 à 30 °C la thermostabilité des versions natives de BmrA, un transporteur ABC procaryote, et de celle d'A2AR, le récepteur humain de l’adénosine. Ils ont aussi permis d’améliorer la diffraction de cristaux de BmrA de 6 à 3,7-4 Å (Angew Chem Int. Ed. 2018, 57:2948). Une collaboration avec le partenaire suédois, IP3, a permis en outre de collecter des données de cryo-microscopie électronique (cryoEM) à une résolution équivalente du complexe BmrA [ATPMg (substrat hydrolysé)-rhodamine 6G (substrat transporté)], correspondant à une conformation jusqu'ici inconnue.
Dans le prolongement, le 1er objectif de CLAMP2 sera de produire 3 à 5 g des 6 meilleurs Clamps/DCODs et de les tester en extraction/purification et échange de détergent, dans le but d’améliorer les données structurales actuelles de BmrA. Ces tests seront étendus à ABCG2, une pompe ABC humaine pour laquelle P1 et P2 ont développé l’inhibiteur le plus efficace in vivo (Oncotarget 2014, 5(23):11957) et visent à obtenir la structure du complexe correspondant dans une perspective d’optimisation. Le partenariat avec IP3 permettra de réaliser les mêmes tests sur Wzz, une PM du complexe Wz de biosynthèse des lipopolysaccharides (LPS) bactériens, dans le but d'améliorer la résolution actuelle (5,5 Å des cristaux et meilleure par cryoEM), ainsi que stabiliser et résoudre la structure du complexe Wzz[LPS].
Un 2ème objectif de CLAMP2 sera de concevoir et synthétiser une 2ème génération de Clamps, avec des groupes PEG et amines à la place de l'oside des DCODs comme générateur de liaisons H. Des résultats préliminaires avec des PEG sont prometteurs en termes de thermostabilisation.
Par ailleurs, des complexes multiprotéiques de PMs à faible affinité d’interaction peuvent être dissociés lors de leur extraction/purification. ABCG2 et Wz illustrent ce cas. De fait la structure RX récente d’ABCG2 (Nature 2017 546-7659:504) est homodimérique alors que les données EM antérieures obtenues par P1 suggèrent un tétramère (BBA 2010 1798-11:2094). Wz est supposé être constitué d'au moins 3 protéines, Wzx qui fait transiter les modules lipido-trisaccharidiques à travers la membrane, Wzy qui les agrège et Wzz qui contrôle la longueur des polymères résultants. Sur la base de résultats récents ayant montré que les DCODs à longue chaine aliphatique stabilisent les oligomères de PMs (réf. ci-dessus), un 3ème objectif de CLAMP2 sera de concevoir, synthétiser et tester des Clamps dimériques et tétramériques, prévus pour stabiliser de tels complexes.
CLAMP2 regroupe 3 équipes couvrant les domaines de la biologie structurale des PMs et de la chimie. P1 et P2 ont travaillé avec succès pour élaborer la 1ère génération de Clamp/DCODs. L'équipe suédoise IP3 élargit l'aspect structural des PMs avec l’étude de grands complexes et en apportant une connaissance approfondie de cryoEM. P1, P2 et IP3 ont déjà initié cette collaboration en 2017.

Coordinateur du projet

Monsieur Pierre Falson (Microbiologie Moléculaire et Biochimie Structurale)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

Stockholm University / Department of Biochemistry and Biophysics
DPM DEPARTEMENT DE PHARMACOCHIMIE MOLECULAIRE
MMSB Microbiologie Moléculaire et Biochimie Structurale

Aide de l'ANR 434 077 euros
Début et durée du projet scientifique : décembre 2018 - 36 Mois

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